張 旻，姜紹通*，鄭 志，潘麗軍，李興江，羅水忠，吳學(xué)鳳

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

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米根霉AS 3.819基因啟動(dòng)子片段的克隆及功能鑒定

張 旻，姜紹通*，鄭 志，潘麗軍，李興江，羅水忠，吳學(xué)鳳

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

摘 要：從L-乳酸生產(chǎn)菌米根霉（Rhizopus oryzae）菌株AS 3.819基因組DNA中分別擴(kuò)增得到了乳酸脫氫酶基因（ldhA）、丙酮酸脫氫酶基因（pdcA）、淀粉糖化酶基因（amyA）以及磷酸甘油酸酯激酶基因（pgk1）的啟動(dòng)子片段，并構(gòu)建啟動(dòng)子探針載體pUKMR，以β-內(nèi)酰胺酶基因（bla）為報(bào)告基因在大腸桿菌JM109中對(duì)這些啟動(dòng)子片段進(jìn)行篩選及啟動(dòng)活性檢測(cè)。結(jié)果表明：4 種啟動(dòng)子片段成功啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)；在非底物誘導(dǎo)情況下，ldhA和pgk1啟動(dòng)子啟動(dòng)活性較強(qiáng)；在有合適碳源底物誘導(dǎo)情況下pdcA和amyA啟動(dòng)子擁有更高的啟動(dòng)活性；ldhA基因的啟動(dòng)子啟動(dòng)活性隨著啟動(dòng)子片段長(zhǎng)度的增加有一定提高，而在長(zhǎng)度為500 bp以上時(shí)，其啟動(dòng)活性變化不明顯。本研究為Rhizopus oryzae提供了一種快速簡(jiǎn)便的啟動(dòng)子捕獲分離及啟動(dòng)活性檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：米根霉；大腸桿菌；啟動(dòng)子探針載體；β-內(nèi)酰胺酶；乳酸脫氫酶

米根霉（Rhizopus oryzae）是一種重要的工業(yè)微生物，能夠利用葡萄糖等己糖、木糖等戊糖、淀粉及木質(zhì)纖維素等碳源生產(chǎn)高純度L-乳酸[1-6]及其他有機(jī)酸[7-8]，在食品、醫(yī)藥、化學(xué)工業(yè)、皮革、香料等領(lǐng)域具有廣泛的用途。同其他許多絲狀真菌一樣，由于培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，具有高效的分泌表達(dá)系統(tǒng)以及易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，米根霉也有著應(yīng)用于同源或者異源蛋白表達(dá)，成為一種高效基因工程菌的潛力。但是由于穩(wěn)定可靠的針對(duì)野生型或者工業(yè)米根霉菌株的遺傳轉(zhuǎn)化方法尚未發(fā)展成熟，對(duì)米根霉的遺傳改造工作目前仍然存在較大的難度。

啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，對(duì)于基因表達(dá)水平有著重要的影響。隨著絲狀真菌遺傳改造研究越來(lái)越深入，越來(lái)越多的真菌基因的啟動(dòng)子被分離及鑒定，并被應(yīng)用于真菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建當(dāng)中。對(duì)于米根霉而言，獲取高效穩(wěn)定或者可調(diào)控的啟動(dòng)子對(duì)于米根霉表達(dá)載體構(gòu)建也是十分重要的。啟動(dòng)子片段的分離一般采用啟動(dòng)子探針質(zhì)粒捕獲的方法，包括從基因組文庫(kù)篩選以及從聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物中篩選啟動(dòng)子片段，而啟動(dòng)子片段的克隆方法又包括常規(guī)PCR法、反向PCR法、鍋柄PCR法、序列特異性引物PCR法、熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR法和Y型接頭擴(kuò)增法等[9]。啟動(dòng)子探針質(zhì)粒依靠其中的報(bào)告基因?qū)?dòng)子片段進(jìn)行篩選以及功能分析[10-13]。在啟動(dòng)子探針質(zhì)粒構(gòu)建當(dāng)中，常常選擇綠色熒光蛋白（green fluorescent protein）基因[14]、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）基因[15]及β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucoronidase）基因[16]作為報(bào)告基因。另外一種類型的啟動(dòng)子探針載體則是以抗性標(biāo)記基因作為報(bào)告基因，包括氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因以及潮霉素抗性基因等[17-20]。

本研究以pUC18克隆載體為載體構(gòu)建基礎(chǔ)，β-內(nèi)酰胺酶（β-lactamase）基因bla（氨芐青霉素抗性基因）為報(bào)告基因構(gòu)建探針質(zhì)粒。應(yīng)用此探針載體在大腸桿菌JM109當(dāng)中進(jìn)行米根霉基因啟動(dòng)子的篩選，并通過(guò)測(cè)定轉(zhuǎn)化子氨芐青霉素耐受性，β-內(nèi)酰胺酶活性，檢測(cè)并比較幾種啟動(dòng)子片段的啟動(dòng)活性，以期為米根霉或其他絲狀真菌的啟動(dòng)子片段快速簡(jiǎn)便的捕獲分離方法提供參考。

1　材料與方法

1.1菌株

米根霉（Rhizopus oryzae）AS 3.819菌株 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所（菌種保藏編號(hào)：CICC40313）；大腸桿菌Escherichia coli JM109 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2質(zhì)粒

本研究所用到的質(zhì)粒均列于表1中。

表1　本研究所用質(zhì)粒Table 1 Plasmids used in this study

1.3試劑與儀器

1.3.1 試劑

rTaq DNA聚合酶，DNA限制性內(nèi)切酶SspⅠ、NdeⅠ、EcoRⅤ和SmaⅠ，T4連接酶，DNA Marker，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside， IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside，X-Gal）、去磷酸化酶（alkaline phosphatase）來(lái)自于E. coli C75以及pUC18載體 日本TaKaRa公司；硫酸卡那霉素（kanamycin）北京Solarbio公司；氨芐青霉素（ampicillin） 美國(guó)Amersco公司；β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；青霉素鉀鹽 中國(guó)藥品生物制品檢定所；PCR產(chǎn)物膠回收純化試劑盒 美國(guó)Axygen公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒以及pEASY-T1克隆載體試劑盒 北京全式金生物工程有限公司；Amicon Ultra-15超濾管及超濾膜 美國(guó)Merck Millipore公司。

1.3.2 儀器與設(shè)備

TC-96 PCR儀 杭州博日科技有限公司；Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；Himac CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；TU-1901紫外分光光度計(jì) 北京普析分析儀器公司。

1.4引物

根據(jù)米根霉基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. broadinstitute.org/annotation/genome/rhizopus_ oryzae/MultiHome.html）中公布的各個(gè)基因的旁側(cè)序列，設(shè)計(jì)引物ldhpF以及l(fā)dhpR（兩端引入SmaⅠ酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增ldhA基因的啟動(dòng)子區(qū)域片段PldhA；設(shè)計(jì)引物pdcpF以及pdcpR（兩端引入SmaⅠ酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增pdcA基因的啟動(dòng)子區(qū)域片段PpdcA；設(shè)計(jì)引物amypF及amypR（兩端引入EcoRⅤ酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增amyA基因的啟動(dòng)子區(qū)域片段PamyA；設(shè)計(jì)引物pgkpF以及pgkpR（兩端引入SmaⅠ酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增pgk1基因的啟動(dòng)子區(qū)域片段Ppgk1；根據(jù)pEASY-T1質(zhì)粒的序列設(shè)計(jì)引物KmrU（引入SspⅠ及EcoRⅤ酶切位點(diǎn)）及KmrD（引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)）從pEASY-T1質(zhì)粒上擴(kuò)增卡那霉素抗性基因及其上下游序列。以上引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。引物序列列于表2中。

表2　PCR所用引物及其序列Taabbllee 2 Primers used for PCR process and their sequences

1.5方法

1.5.1 米根霉基因啟動(dòng)子片段分離

從米根霉斜面上制取孢子乳懸液，并按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種到培養(yǎng)基中。米根霉培養(yǎng)所用培養(yǎng)基成分如下：葡萄糖120 g/L、硫酸銨4 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸二氫鈉0.3 g/L、硫酸鋅0.44 g/L、硫酸鎂0.25 g/L。32 ℃振蕩培養(yǎng)12 h左右。當(dāng)培養(yǎng)液中有均勻分散的米根霉菌絲體時(shí)便可取出進(jìn)行基因組DNA的提取。

米根霉菌體基因組提取過(guò)程參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南有關(guān)內(nèi)容并加以改進(jìn)[21]。以基因組DNA為模板進(jìn)行各個(gè)啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增片段的回收純化、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、質(zhì)粒提取、酶切及回收等過(guò)程參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南。

1.5.2 啟動(dòng)子探針載體的構(gòu)建

啟動(dòng)子探針質(zhì)粒的骨架來(lái)源于pUC18克隆載體見(jiàn)表1。用限制性內(nèi)切酶SspⅠ以及NdeⅠ酶切pUC18質(zhì)粒，切除368 bp含有β-內(nèi)酰胺酶基因的啟動(dòng)子的片段，使此基因無(wú)法表達(dá)，并獲得含有SspⅠ及NdeⅠ酶切黏性末端的線性質(zhì)粒。同時(shí)將用引物KmrU及KmrD擴(kuò)增并克隆得到的1.1 kb帶有卡那霉素抗性基因（kan）的表達(dá)盒片段與其進(jìn)行連接（此片段5’端含SspⅠ及EcoRⅤ酶切位點(diǎn)，3’端含NdeⅠ酶切位點(diǎn)），轉(zhuǎn)化大腸桿菌并用40 μg/mL的卡那霉素進(jìn)行篩選，由此得到探針質(zhì)粒pUKMR。此質(zhì)粒的原SspⅠ酶切位點(diǎn)相鄰處存在由引物引入的EcoRⅤ位點(diǎn)，可通過(guò)此酶切位點(diǎn)插入待篩選的平末端啟動(dòng)子片段，并可能啟動(dòng)β-內(nèi)酰胺酶基因的表達(dá)，使宿主菌獲得氨芐青霉素抗性。

1.5.3 米根霉基因啟動(dòng)子在大腸桿菌E. coli JM109中的啟動(dòng)活性檢測(cè)

1.5.3.1 啟動(dòng)子片段的篩選

構(gòu)建的啟動(dòng)子探針質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切、去磷酸化處理之后回收，與同樣經(jīng)過(guò)酶切回收的啟動(dòng)子片段進(jìn)行過(guò)夜連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli JM109，以氨芐青霉素為抗性標(biāo)記篩選得到含重組質(zhì)粒的抗性轉(zhuǎn)化子。挑選抗性轉(zhuǎn)化子菌落于含50 μg/mL的氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，并通過(guò)PCR檢測(cè)及測(cè)序檢測(cè)確認(rèn)是否連入了啟動(dòng)子片段。

篩選并鑒定出的轉(zhuǎn)化子經(jīng)培養(yǎng)之后采用平板劃線的方式接種于含不同質(zhì)量濃度（50、80、100、150、180、200、220、250、300 μg/mL）的氨芐青霉素的固體LB平板上，觀察β-內(nèi)酰胺酶基因在各個(gè)啟動(dòng)子片段啟動(dòng)作用下的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子對(duì)氨芐青霉素的耐受性，并由此初步考察這幾種啟動(dòng)子片段的啟動(dòng)活性。

1.5.3.2 β-內(nèi)酰胺酶活力檢測(cè)

β-內(nèi)酰胺酶活力檢測(cè)參考文獻(xiàn)[22]方法，取對(duì)氨芐青霉素具有抗性的上述菌落，接種在含有40 μg/mL的卡那霉素的50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)18 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期收集菌液。8 000 r/min離心10 min，收集培養(yǎng)上清液，通過(guò)Amicon Ultra-15超濾管（超濾膜截留分子質(zhì)量10 000 D）超濾濃縮10 倍至5 mL。濃縮后的上清用以測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶活力。酶活力測(cè)定采用以青霉素鉀為底物，2,2’-聯(lián)喹啉為顯色劑的方法，在分光光度計(jì)下檢測(cè)反應(yīng)后顏色對(duì)比計(jì)算樣品中β-內(nèi)酰胺酶活力。測(cè)定方法如下：1 mL含5 000 U/mL青霉素鉀的醋酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0）中加入0.1 mL濃縮上清樣品，37 ℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后添加1 mL的13 g/100 mL三氯乙酸溶液，混合均勻后于4 000 r/min離心10 min，取上清0.2 mL，添加0.05 g/100 mL的2,2’-聯(lián)喹啉4.8 mL，混合均勻后添加20 mmol/L的CuSO4溶液0.4 mL，混合均勻室溫靜置顯色15 min后，在分光光度計(jì)中于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，空白對(duì)照中樣品替換為等量LB液體培養(yǎng)基。并以β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品制作酶活力-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃縮樣品酶活力（U/mL）。1.5.3.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

測(cè)定1.5.3.2節(jié)中濃縮處理得到的培養(yǎng)上清液中的可溶蛋白質(zhì)含量，測(cè)定方法參照Bradford法[23]。

2　結(jié)果與分析

2.1基因啟動(dòng)子片段克隆

圖1　米根霉AS 3.819基因啟動(dòng)子片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of gene promoter fragments from R. oryzae AS 3.819

以米根霉AS 3.819基因組DNA為模板，ldhpF及l(fā)dhpR為引物擴(kuò)增PldhA片段，得到約250 bp大小的特異性條帶（圖1A）；pdcpF及pdcpR為引物擴(kuò)增PpdcA片段，獲得約1 000 bp大小的特異性條帶（圖1B）；amypF及amypR為引物擴(kuò)增PamyA片段，獲得約900 bp大小的特異性條帶（圖1C）；pgkpF及pgkpR為引物擴(kuò)增Ppgk1片段，獲得約500 bp大小的特異性條帶（圖1D）。從電泳結(jié)果來(lái)看，與設(shè)計(jì)中4 條片段的260、1 080、896、541 bp長(zhǎng)度相符合。4 條片段送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果對(duì)比NCBI以及米根霉基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)相應(yīng)片段的序列，結(jié)果表明擴(kuò)增片段序列正確。

2.2啟動(dòng)子探針質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

如1.5.2節(jié)部分所述，本研究中所構(gòu)建的探針載體pUKMR在其β-內(nèi)酰胺酶編碼基因的上游缺失啟動(dòng)子部分，此載體無(wú)法使宿主獲得氨芐青霉素抗性。只有在此位點(diǎn)插入具有啟動(dòng)功能的片段才能重新讓?duì)?內(nèi)酰胺酶編碼基因在其調(diào)控之下進(jìn)行表達(dá)，并通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選出轉(zhuǎn)化子。

A圖：1. 250 bp DNA Ladder Marker標(biāo)準(zhǔn)，2. 含kan基因的表達(dá)盒片段的PCR產(chǎn)物；B圖：1. 250 bp DNA Ladder Marker標(biāo)準(zhǔn)，2. pUKMR質(zhì)粒提取，3、4. pUKMR質(zhì)粒EcoR Ⅴ單酶切后產(chǎn)物，5. DL15000 DNA Marker標(biāo)準(zhǔn)。

圖 22 kkaann基因表達(dá)盒PCR擴(kuò)增與質(zhì)粒pUUKKMMRR的EEccooRⅤ單酶切鑒定結(jié)果

Fig.2 PCR amplification of kan gene and restriction enzyme digestion

test of plasmid pUKMR with EcoRⅤ

卡那霉素抗性基因（kan）是以pEASY-T1質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得的（圖2A），替換pUC18載體上的β-內(nèi)酰胺酶編碼基因（bla）的啟動(dòng)子部分構(gòu)建成pUKMR質(zhì)粒。通過(guò)卡那霉素抗性篩選出轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子分別接種于含40 μg/mL卡那霉素及含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行比較，結(jié)果轉(zhuǎn)化子能在含40 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而無(wú)法在含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，說(shuō)明篩選出的轉(zhuǎn)化子確實(shí)已經(jīng)不具備氨芐青霉素抗性了，可以認(rèn)為探針載體pUKMR的bla上游是缺失啟動(dòng)子的。質(zhì)粒經(jīng)過(guò)EcoRⅤ限制性內(nèi)切酶單酶切并回收后將產(chǎn)生的平末端進(jìn)行去磷酸化處理，獲得帶平末端的探針載體，便可與同樣平末端的啟動(dòng)子片段進(jìn)行連接。從經(jīng)過(guò)EcoRⅤ限制性內(nèi)切酶單酶切后產(chǎn)生的線性載體的電泳結(jié)果來(lái)看，大小與預(yù)期的3 349 bp大小相符合（圖2B）。

2.3各啟動(dòng)子片段在大腸桿菌E. coli JM109中的啟動(dòng)功能

2.3.1 啟動(dòng)子的篩選及其啟動(dòng)活性比較

由于在PldhA、PpdcA、PamyA及Ppgk1片段的兩端引入了EcoRⅤ或SmaⅠ位點(diǎn)，因此通過(guò)EcoRⅤ或SmaⅠ酶切獲得帶平末端的啟動(dòng)子片段。通過(guò)T4連接酶將其與去磷酸化的線性平末端探針載體pUKMR過(guò)夜連接，之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli JM109，并且通過(guò)50 μg/mL的氨芐青霉素進(jìn)行篩選，獲得了pUK-PldhA、pUK-PpdcA、pUK-PamyA及pUK-Ppgk1轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒分別經(jīng)過(guò)了PCR和酶切驗(yàn)證，表明啟動(dòng)子片段都已插入到了探針載體pUKMR上并替換了β-內(nèi)酰胺酶基因原來(lái)的啟動(dòng)子。

將成功轉(zhuǎn)化pUK-PldhA、pUK-PpdcA、pUK-PamyA及pUK-Ppgk1重組質(zhì)粒而獲得氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子分別采用平板劃線的方式接種于含有50、80、100、150、180、200、220、250、300 μg/mL氨芐青霉素的固體LB平板上于37 ℃培養(yǎng)12 h，經(jīng)過(guò)抗性檢測(cè)比較3 種轉(zhuǎn)化子對(duì)氨芐青霉素的耐受能力，并以轉(zhuǎn)化pUC18質(zhì)粒的E. coli JM109為對(duì)照。由表3可知，轉(zhuǎn)化入pUK-PldhA的轉(zhuǎn)化子可以耐受最高達(dá)200 μg/mL的氨芐青霉素，而使用pUK-PpdcA以及pUK-PamyA得到的轉(zhuǎn)化子其耐受氨芐青霉素能力均比pUC18轉(zhuǎn)化子低，在150 μg/mL 氨芐青霉素的LB平板中已經(jīng)無(wú)法生長(zhǎng)，這4 種轉(zhuǎn)化子中以pUK-Ppgk1轉(zhuǎn)化子耐受性最高，能耐受高達(dá)250 μg/mL的氨芐青霉素。

表3　含不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子對(duì)氨芐青霉素的耐受性Table 3 Ampicillin resistance of recombinants containing different promoters

2.3.2 含啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)化子β-內(nèi)酰胺酶活性比較

圖3　不同啟動(dòng)子作用下表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶活性Fig.3 Activity of β-lactamase expressed under the control of different promoters

篩選出的含4 種啟動(dòng)子的重組轉(zhuǎn)化子，分別經(jīng)過(guò)含40 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，按照1.5.3.2節(jié)方法測(cè)定轉(zhuǎn)化子分泌的β-內(nèi)酰胺酶活力。如圖3所示，含不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子其胞外蛋白中β-內(nèi)酰胺酶的活力及比活力均有所差別，其表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶量有所差別，間接可以反映出各個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)β-內(nèi)酰胺酶基因表達(dá)強(qiáng)度的不同。其中以攜帶pgk1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子其表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶活性最高，其次為含ldhA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子。而amyA及pdcA基因啟動(dòng)子在此條件下啟動(dòng)能力低于pUC18中原β-內(nèi)酰胺酶基因bla自帶的啟動(dòng)子。此結(jié)果與2.3.1節(jié)中各個(gè)轉(zhuǎn)化子對(duì)氨芐青霉素的耐受性比較結(jié)果相吻合。通過(guò)此結(jié)果可以得知，在LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，啟動(dòng)子啟動(dòng)能力為Ppgk1＞PldhA＞PpdcA＞PamyA，其中PamyA和PpdcA啟動(dòng)能力低于pUC18中自帶的啟動(dòng)子。

2.4啟動(dòng)子在不同碳源下的啟動(dòng)活性

微生物代謝過(guò)程中，許多碳代謝相關(guān)途徑中的關(guān)鍵酶的表達(dá)往往會(huì)受到培養(yǎng)底物的誘導(dǎo)或抑制，其原因之一可能是由于代謝底物自身或者代謝中間物對(duì)于相關(guān)酶基因啟動(dòng)子區(qū)域上的元件的作用使得基因的表達(dá)得到增強(qiáng)或抑制，這也是微生物發(fā)酵代謝調(diào)控的重要基礎(chǔ)之一?；虮磉_(dá)類型分為誘導(dǎo)型表達(dá)、組成型表達(dá)和組織特異型表達(dá)，主要取決于啟動(dòng)子啟動(dòng)基因表達(dá)的模式。其中誘導(dǎo)型表達(dá)的基因其啟動(dòng)子在培養(yǎng)過(guò)程中未添加誘導(dǎo)物的情況下，不啟動(dòng)基因表達(dá)或者以一定的水平進(jìn)行本底表達(dá)。這在代謝調(diào)控研究中有著十分重要的意義，可是使微生物在不同生長(zhǎng)條件下合理分配代謝流量在代謝網(wǎng)絡(luò)中的分布，節(jié)省自身能量消耗并且充分利用資源。

在包括米根霉在內(nèi)的絲狀真菌中，碳代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的部分酶蛋白基因的表達(dá)類型屬于誘導(dǎo)型表達(dá)，其表達(dá)量隨底物中碳源的不同存在很大的區(qū)別。從2.3.2節(jié)結(jié)果得知，在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下amyA和pdcA基因啟動(dòng)子啟動(dòng)bla表達(dá)的能力較低。本研究比較了在不同碳源作為培養(yǎng)底物情況下各啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性的變化。在含不同質(zhì)量濃度梯度氨芐青霉素的LB篩選培養(yǎng)基中各添加了葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油及淀粉至終質(zhì)量濃度為5 g/L，分別在這些平板上劃線接種含不同啟動(dòng)子的宿主菌株，觀察生長(zhǎng)情況。如表4～7所示，PpdcA和PamyA在不同碳源底物誘導(dǎo)作用下表現(xiàn)出一定的啟動(dòng)活性差別，使得宿主大腸桿菌氨芐青霉素耐受性出現(xiàn)變化。其中PpdcA啟動(dòng)活性在葡萄糖和蔗糖中得到了一定的提升，在淀粉和麥芽糖中啟動(dòng)活性與普通篩選LB相比無(wú)顯著變化，而在甘油中其啟動(dòng)活性喪失，宿主菌無(wú)法在含有甘油的LB篩選平板上生長(zhǎng)。PamyA則在淀粉中啟動(dòng)活性表現(xiàn)出較高的增強(qiáng)，在葡萄糖及蔗糖中啟動(dòng)活性有一定的增加，在甘油及麥芽糖中啟動(dòng)活性與普通LB篩選培養(yǎng)基中相比基本無(wú)差別。相比之下，PldhA和Ppgk1的啟動(dòng)活性則受碳源底物種類的影響則不大，除甘油中Ppgk1啟動(dòng)活性受到較大影響外，其他篩選培養(yǎng)基下生長(zhǎng)狀況和普通LB篩選培養(yǎng)基中無(wú)明顯區(qū)別。

表4　不同碳源底物下含llddhhAA基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子對(duì)氨芐青霉素的耐受性Table 4 Ampicillin resistance of recombinants containing ldhA promoter with different carbon substratess

表5　不同碳源底物下含pdcA基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子對(duì)氨芐青霉素的耐受性Table 5 Ampicillin resistance of recombinants containing pdcA promoter with different carbon substratess

表6　不同碳源底物下含aammyyAA基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子對(duì)氨芐青霉素的耐受性TTaabbllee 66 Ampicillin resistance of recombinants containing aammyyAA promoter with different carbon substratess

表7　不同碳源底物下含ppggkk11基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子對(duì)氨芐青霉素的耐受性TTaabbllee 7 Ampicillin resistance of recombinants containing ppggkk11 promoter with different carbon substrates

此外，依照1.5.3.2節(jié)的方法，在各添加了葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油及淀粉至終質(zhì)量濃度為5 g/L的含40 μg/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主菌，分析其表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶活性。如圖4所示，含PamyA的宿主菌在淀粉及葡萄糖中其表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶活性確實(shí)得到了很大的提高，同樣含PpdcA的宿主菌在葡萄糖和蔗糖中β-內(nèi)酰胺酶活性也有提升，而含PldhA和Ppgk1的宿主菌除在甘油條件下以外，隨著碳源底物改變其啟動(dòng)表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶活性變化不大。因此對(duì)比2.3節(jié)部分所得出的結(jié)果，可以認(rèn)為米根霉的amyA及pdcA基因?qū)儆谡T導(dǎo)型表達(dá)，其基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性受到碳源底物的誘導(dǎo)及抑制作用的調(diào)控，其在各自強(qiáng)誘導(dǎo)底物的作用下啟動(dòng)活性達(dá)到相對(duì)較高水平。

圖4　不同碳源底物下4 種啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶活性Fig.4 Activity of β-lactamase expressed under the control of four promoters with different carbon substrates

2.5ldhA基因啟動(dòng)子片段長(zhǎng)度對(duì)于啟動(dòng)活性的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了未曾應(yīng)用于真菌表達(dá)載體構(gòu)建的乳酸脫氫酶A（ldhA）基因啟動(dòng)子，對(duì)其啟動(dòng)活性進(jìn)行了檢測(cè)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)這種啟動(dòng)子啟動(dòng)活性相較其他的啟動(dòng)子（包括受到誘導(dǎo)情況下的PamyA和PpdcA）并不高。除了在本研究所設(shè)置的誘導(dǎo)條件下啟動(dòng)活性未表現(xiàn)出受誘導(dǎo)的現(xiàn)象之外，其相對(duì)較短的長(zhǎng)度也有可能會(huì)致使其啟動(dòng)能力未得到完全的發(fā)揮。因此本研究對(duì)ldhA啟動(dòng)子片段長(zhǎng)度進(jìn)行了增加，搜尋了ldhA上游序列中合適的擴(kuò)增位點(diǎn)，分別使用上游引物ldhpF2、ldhpF3、ldhpF4、ldhpF5以及下游引物ldhpR擴(kuò)增了長(zhǎng)度分別為529、777、1 104、1 363 bp的ldhA啟動(dòng)子片段（分別為PldhA2、PldhA3、 PldhA4、PldhA5），并連入了啟動(dòng)子探針質(zhì)粒pUKMR中。通過(guò)50 μg/mL的氨芐青霉素篩選出抗性菌落，并經(jīng)過(guò)40 μg/mL的卡那霉素和50 μg/mL的氨芐青霉素驗(yàn)證以及PCR驗(yàn)證后得到連入啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子。

在非誘導(dǎo)條件下對(duì)含有不同長(zhǎng)度ldhA啟動(dòng)子片段的宿主的氨芐青霉素耐受性和表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶活性分別進(jìn)行比較。如表8和圖5所示，當(dāng)ldhA啟動(dòng)子片段長(zhǎng)度由260 bp增加到529 bp時(shí)，啟動(dòng)子片段的啟動(dòng)活性有些許增強(qiáng)，而繼續(xù)增加啟動(dòng)子其啟動(dòng)活性卻不再增加，整體看來(lái)ldhA啟動(dòng)子長(zhǎng)度的增加對(duì)于bla基因在大腸桿菌中表達(dá)的增強(qiáng)并不十分明顯。

表8　含不同長(zhǎng)度的llddhhAA啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)化子對(duì)氨芐青霉素的耐受性Taabbllee 8 Ampicillin resistance of recombinants containing llddhhAA promoter fragments of different lengths

圖5　不同長(zhǎng)度的llddhhAA啟動(dòng)子片段作用下表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶活性Fig.5 Activity of β-lactamase expressed under the control of ldhA promoter fragments of different lengths

3　結(jié)論與討論

本研究從米根霉菌株AS 3.819基因組中克隆了4 種基因ldhA、pdcA、amyA和pgk1的啟動(dòng)子片段，將其重組入構(gòu)建的啟動(dòng)子探針載體pUKMR中，并以大腸桿菌為宿主，篩選、檢測(cè)并比較啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性。通過(guò)比較結(jié)果認(rèn)為，在非底物誘導(dǎo)情況下，Ppgk1和PldhA片段均可以作為強(qiáng)啟動(dòng)子應(yīng)用于構(gòu)建米根霉真菌表達(dá)載體。而在有合適碳源底物誘導(dǎo)情況下PpdcA和PamyA擁有更高的啟動(dòng)活性，也可作為誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子得到應(yīng)用。ldhA基因的啟動(dòng)子啟動(dòng)活性隨著啟動(dòng)子片段長(zhǎng)度的增加，啟動(dòng)活性有一定的提高，而在長(zhǎng)度為500 bp以上時(shí)，其啟動(dòng)活性不再增加。

對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)菌株而言，了解其相關(guān)的分子生物學(xué)信息對(duì)于菌種改造、發(fā)酵性能優(yōu)化、提高其工業(yè)應(yīng)用有著十分重要的意義。通過(guò)基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)為基礎(chǔ)的代謝工程改造方法是常用的手段，而遺傳改造所使用的基因表達(dá)載體的構(gòu)建，除了要選擇合適的篩選標(biāo)記外，適用于宿主菌的高效穩(wěn)定或者能夠進(jìn)行人為調(diào)控的基因啟動(dòng)子也是不可或缺的。在真菌當(dāng)中，糖化酶基因（amy）和磷酸甘油酸酯激酶基因（pgk）的啟動(dòng)子作為真菌基因的強(qiáng)啟動(dòng)子得到研究與應(yīng)用[16,24-26]，而且由于兩種基因的表達(dá)類型的不同（amy為誘導(dǎo)型表達(dá)，pgk為組成型表達(dá)），可以分別在不同的培養(yǎng)條件下達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)強(qiáng)度的目的。而丙酮酸脫羧酶基因（pdc）在包括米曲霉在內(nèi)的絲狀真菌中是表達(dá)強(qiáng)度最高的基因之一[27]，因此其啟動(dòng)子也可作為強(qiáng)啟動(dòng)子用于外源基因在米根霉內(nèi)的強(qiáng)表達(dá)。pdcA、amyA和pgk1這幾種基因的啟動(dòng)子片段也分別代表著幾種不同類型的啟動(dòng)子，在發(fā)酵過(guò)程當(dāng)中，對(duì)于不同培養(yǎng)條件其啟動(dòng)基因表達(dá)也會(huì)做出不同的響應(yīng)。在米根霉表達(dá)載體構(gòu)建中應(yīng)用這幾種不同類型的啟動(dòng)子米根霉構(gòu)建不同類型的表達(dá)載體，對(duì)應(yīng)著不同的發(fā)酵底物，如發(fā)酵玉米淀粉（主要碳源底物為淀粉），或者秸稈水解糖（主要含葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等單糖）及葡萄糖，能夠使得表達(dá)載體中的目的基因或者篩選標(biāo)記基因的表達(dá)得到一定的調(diào)控，特異性地增強(qiáng)目的基因的表達(dá)或者在普通發(fā)酵條件下針對(duì)性地“關(guān)閉”篩選標(biāo)記基因的表達(dá)（降低篩選標(biāo)記基因的持續(xù)表達(dá)對(duì)宿主米根霉轉(zhuǎn)化子造成的代謝負(fù)擔(dān)）。而本研究中所涉及到的乳酸脫氫酶基因（ldh）啟動(dòng)子目前未有報(bào)道對(duì)其進(jìn)行過(guò)研究。米根霉是一種重要的有機(jī)酸生產(chǎn)菌株，米根霉AS 3.819轉(zhuǎn)化底物碳源為L(zhǎng)（＋）-乳酸的轉(zhuǎn)化率高，其丙酮酸代謝節(jié)點(diǎn)的代謝流量進(jìn)入乳酸代謝支路的關(guān)鍵酶是乳酸脫氫酶。因此本研究對(duì)ldhA基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性進(jìn)行了研究，對(duì)其不同啟動(dòng)子片段長(zhǎng)度的啟動(dòng)能力做了比較，為選擇適當(dāng)?shù)膌dhA啟動(dòng)子片段長(zhǎng)度提供了參考。另一方面，在本研究中，ldhA啟動(dòng)子活性受碳源底物的影響并不明顯，可能說(shuō)明ldhA基因表達(dá)為組成型而非誘導(dǎo)型，但也有可能是因?yàn)閘dhA基因的表達(dá)強(qiáng)度受其他培養(yǎng)底物或者相關(guān)代謝途徑中的代謝中間物而非碳源底物的影響。其啟動(dòng)子啟動(dòng)基因表達(dá)確切的類型仍需進(jìn)一步研究。

應(yīng)用啟動(dòng)子探針載體對(duì)擁有啟動(dòng)功能的DNA片段進(jìn)行捕獲分離是一種常用的啟動(dòng)子研究手段。目前包括米根霉在內(nèi)的部分絲狀真菌還未建立十分高效穩(wěn)定且適用范圍較廣的遺傳轉(zhuǎn)化體系，米根霉的主要遺傳轉(zhuǎn)化方法也是基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記，應(yīng)用于野生及工業(yè)應(yīng)用的米根霉菌株尚且存在困難[13,28]，在這些絲狀真菌中進(jìn)行傳統(tǒng)的啟動(dòng)子探針質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化往往得不到理想的效果，給啟動(dòng)子研究帶來(lái)不便。目前已有研究將絲狀真菌的啟動(dòng)子在細(xì)菌中啟動(dòng)目的標(biāo)記基因的表達(dá)用以研究其啟動(dòng)表達(dá)性能[20,29]，且仍有部分啟動(dòng)子保留其啟動(dòng)基因表達(dá)的類型，說(shuō)明這些絲狀真菌的基因啟動(dòng)子即使在某些其他的宿主中仍然能有著其基本的啟動(dòng)功能。基于此考慮本研究所構(gòu)建的啟動(dòng)子探針載體將米根霉的啟動(dòng)子用于在大腸桿菌中啟動(dòng)β-內(nèi)酰胺酶基因（bla）的表達(dá)，并檢測(cè)了啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性。通過(guò)這種方法的建立，為米根霉或其他絲狀真菌的啟動(dòng)子片段快速簡(jiǎn)便的捕獲分離方法提供參考與借鑒。當(dāng)然由于啟動(dòng)子在不同的宿主當(dāng)中的作用應(yīng)當(dāng)要考慮宿主的基因表達(dá)特性以及目標(biāo)基因的特異性，篩選所得到的啟動(dòng)子的在米根霉或者絲狀真菌中啟動(dòng)基因表達(dá)的可靠性以及具體的效果仍需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。在本研究的基礎(chǔ)上，將進(jìn)一步建立并發(fā)展米根霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，并且依靠這種遺傳轉(zhuǎn)化方法更深入地分析各種啟動(dòng)子片段在米根霉中的基因啟動(dòng)特性，為米根霉遺傳改造工作提供更多理論依據(jù)。

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Cloning and Functional Characterization of Gene Promoters from Rhizopus oryzae AS 3.819

ZHANG Min, JIANG Shaotong*, ZHENG Zhi, PAN Lijun, LI Xingjiang, LUO Shuizhong, WU Xuefeng
(Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract:In this paper, promoter fragments of four genes, lactate dehydrogenase A (ldhA), pyruvate decarboxylase A (pdcA), glucoamylase A (amyA) and phosphoglycerate kinase 1 (pgk1), from genome DNA of Rhizopus oryzae strain AS 3.819, were amplified and screened in Escherichia coli strain JM109 by using promoter probe vector pUKMR containing β-lactamase gene (bla) as its reporter gene. The results suggested that the four promoter fragments all possessed the ability to drive the expression of the β-lactamase gene. The promoters of ldhA and pgk1 genes possessed high promoting strength even though no inducing substrate was present, while the strength of pdcA and amyA promoters could be enhanced when the suitable carbon source was adopted. The strength of ldhA promoter was enhanced as the fragment length increased until it reached 500 bp. This research provides a quick and easy method to isolate and detect gene promoters form Rhizopus oryzae.

Key words:Rhizopus oryzae; Escherichia coli; promoter probe vector; β-lactamase; lactate dehydrogenase

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507014

中圖分類號(hào)：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2015）07-0071-08

*通信作者：姜紹通（1954—），男，教授，本科，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵工程、大宗農(nóng)產(chǎn)品資源生物轉(zhuǎn)化加工和油脂加工工程。E-mail：zming19861028@hotmail.com

作者簡(jiǎn)介：張旻（1986—），男，博士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵與生物技術(shù)。E-mail：zming19861028@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31071636；31171741；31470002）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101352）

收稿日期：2014-11-08