李鵬斌， 車(chē) 彪， 張振興， 王 凱

(長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院骨科， 湖北 武漢 430010)

BMSCs在功能化自組裝多肽水凝膠中定向分化神經(jīng)細(xì)胞研究*

李鵬斌， 車(chē) 彪， 張振興， 王 凱＊＊

(長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院骨科， 湖北 武漢 430010)

目的:探討骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在功能化自組裝多肽水凝膠中定向分化為神經(jīng)細(xì)胞及分化后細(xì)胞的功能特征。方法:制備功能化自組裝多肽水凝膠，分別將BMSCs接種于RADA16自組裝多肽水凝膠(對(duì)照組)與功能化自組裝多肽水凝膠(實(shí)驗(yàn)組)表面，觀察細(xì)胞遷移情況。用預(yù)誘導(dǎo)劑bFGF和EGF及定向誘導(dǎo)劑(SHH+RA)時(shí)序誘導(dǎo)，應(yīng)用Nestin、MAP2、GFAP、ChAT和VAT染色，比較分化后神經(jīng)樣細(xì)胞的形態(tài)和功能標(biāo)志的差異。結(jié)果:BMSCs在功能化自組裝多肽水凝膠中共培養(yǎng)及誘導(dǎo)劑的特定組合和時(shí)序的誘導(dǎo)下增殖分化呈現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞樣改變，MAP2陽(yáng)性細(xì)胞百分率較對(duì)照組顯著提高(P＜0.05)，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞百分率較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，且功能標(biāo)志ChAT和VAT只在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)。結(jié)論:BMSCs在功能化自組裝多肽水凝膠中能定向誘導(dǎo)分化為具有功能的神經(jīng)細(xì)胞。

水凝膠; 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞; 自組裝多肽; 神經(jīng)細(xì)胞

IKVAV(異亮氨酸－賴(lài)氨酸－纈氨酸－丙氨酸－纈氨酸)是層粘連蛋白的核心五肽活性片段，能促進(jìn)神經(jīng)元分化、黏附和軸突生長(zhǎng)，抑制膠質(zhì)細(xì)胞分化和黏附［1～3］。RADAl6(精氨酸－丙氨酸－天冬氨酸－丙氨酸－16)是自我互補(bǔ)的兩親性多肽，在水溶液中能自組裝成含水量超過(guò)99%的水納米凝膠纖維，可運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣至其定植的細(xì)胞內(nèi)。本研究在RADAl6的羧基末端鏈接 IKVAV模體合成 RADAl6－IKVAV，將RADAl6與多肽RADAl6－IKVAV混合制備自組裝多肽水凝膠，并檢測(cè)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在自組裝多肽水凝膠中定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能及功能特征。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要試劑:4周齡SD大鼠，體重約100g; BMSCs購(gòu)自Cyagen公司;BMSCs培養(yǎng)試劑購(gòu)于Gibco公司;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、維甲酸(RA)、SHH購(gòu)自Sigma公司;兔抗大鼠nestin抗體、兔抗大鼠ChAT抗體、AT抗體、GFAP抗體、MAP－2抗體購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 材料:多肽RADA16的序列為:AcN－RADARADARADARADA－CONH2，多肽RADA16－IKVAV的序列為:can－RADARADARADARADA－GG－IKVAVCONH2。將0.5%RADA16溶液與0.5%RADA16－IKVAV溶液以4∶1的體積比混合制備功能化自組裝多肽溶液。

1.3 原子力顯微鏡檢測(cè):將0.5%功能化自組裝多肽溶液超聲波破碎30min，然后稀釋到0.01%的工作濃度，吸取溶液10μL滴到新剝離的云母片表面，置于室溫下自然干燥，用NanoscopeIV原子力顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 BMSCs與水凝膠復(fù)合培養(yǎng):將0.5%RADA16溶液與0.5%功能化自組裝多肽溶液超聲波破碎30min，然后將濃度稀釋為0.25%，100uL/孔加至Transwell小室上室的聚碳酸脂膜，加入BMSCs培養(yǎng)基觸發(fā)多肽溶液自組裝，37℃孵育30min產(chǎn)生水凝膠。取第六代BMSCs，以200uL/孔種植于RADA16自組裝多肽水凝膠(對(duì)照組)與功能化自組裝多肽水凝膠(實(shí)驗(yàn)組)表面。(預(yù)誘導(dǎo)劑)各5ng/mL的bFGF和EGF、(譜系定向誘導(dǎo)劑)2μmoL/mL RA和15ng/mL Shh。開(kāi)始每組加預(yù)誘導(dǎo)液，6d后改為混合誘導(dǎo)，每3d換一次液，18d停止誘導(dǎo)。

1.5 誘導(dǎo)細(xì)胞鑒定:不定期對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞分別進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、MAP2、ChAT和 VAT的免疫組化鑒定。用 Hoechst33342對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，用激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)抗原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和Hoechst33342染色陽(yáng)性的正常細(xì)胞的胞核數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞在總細(xì)胞數(shù)中所占的比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SigmaPlot12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 功能化納米水凝膠纖維原子力顯微鏡檢測(cè)結(jié)果:多肽RADA16與多肽RADA16－IKVAV混合自組裝形成多肽水凝膠(圖1A)，通過(guò)原子力顯微鏡下觀察功能化自組裝多肽水凝膠由納米纖維交織形成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，纖維直徑為20～30nm，長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)百納米(圖1B)。

圖1 多肽水凝膠和功能化納米水凝膠纖維結(jié)構(gòu)

2.2 BMSCs分化為神經(jīng)元的形態(tài)變化:接種后細(xì)胞數(shù)量較多，突起較長(zhǎng)，并交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，加預(yù)誘導(dǎo)液6d細(xì)胞增值迅速，6d后加入誘導(dǎo)劑后細(xì)胞間隙增寬，可見(jiàn)細(xì)胞突起伸長(zhǎng)，細(xì)胞間可形成連接，10d后實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)神經(jīng)干細(xì)胞球狀形態(tài)減少，出現(xiàn)花瓣?duì)钚螒B(tài)(圖2A)，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞的多個(gè)突起發(fā)出分支，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的變化明顯高于對(duì)照組(圖2B)，16d后細(xì)胞轉(zhuǎn)化達(dá)到峰值，形態(tài)穩(wěn)定，呈典型的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，對(duì)照組表現(xiàn)不明顯。

圖2 神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)

2.3 神經(jīng)元細(xì)胞免疫組化鑒定:預(yù)誘導(dǎo)4d開(kāi)始出現(xiàn)nestin表達(dá)陽(yáng)性，中期6～12d加誘導(dǎo)劑后nestin陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始減少，實(shí)驗(yàn)組明顯多于對(duì)照組，發(fā)綠色熒光(13.014±3.124)%(圖3A)，神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組增多，實(shí)驗(yàn)組為MAP2(59.171±1.839)%(圖3B)和GFAP(22.103±1.034)%(圖3C)，對(duì)照組為MAP2(29.354±4.845)%和GFAP(36.354±4.846)%，表明BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，ChAT只在實(shí)驗(yàn)組綠色熒光分布以胞核核膜為主的陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)，比例為(42.356±3.741)%(圖 3D)。12～18d后，實(shí)驗(yàn)組MAP2(72.536±1.018)%、GFAP(21.536±1.018)%，明顯高于對(duì)照組MAP2(31.016±2.371)%和GFAP(23.451±3.735)%，ChAT開(kāi)始分布在胞核周?chē)?，隨細(xì)胞突起增長(zhǎng)，向突起中延伸，并實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)VAT紅色熒光的陽(yáng)性細(xì)胞，且細(xì)胞陽(yáng)性率為 ChAT(45.112±3.044)%、VAT(28.223±1.716)%(圖3E)，對(duì)照組為陰性。

圖3 神經(jīng)元細(xì)胞免疫熒光

3 討 論

多肽分子源于自然界，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無(wú)毒副反應(yīng)及免疫反應(yīng)，具有好的生物相容性，張曙光等［4］首次從酵母蛋白中發(fā)現(xiàn)了一組可自組裝的離子互補(bǔ)型多肽，開(kāi)拓了分子自組裝技術(shù)的新領(lǐng)域，隨后設(shè)計(jì)合成了可支持多種細(xì)胞三維生長(zhǎng)的RADA16自組裝多肽水凝膠［5］，近幾年來(lái)許多研究者通過(guò)改變多肽的氨基酸序列，已設(shè)計(jì)出了眾多具有特殊功能的納米自組裝材料應(yīng)用于不同的科研領(lǐng)域［6，7］，這種多肽可根據(jù)細(xì)胞的特征改變自身序列和電荷，為細(xì)胞量身打造專(zhuān)用生存環(huán)境，可以模擬充盈水性液體的機(jī)體組織，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供一個(gè)理想的生活環(huán)境，在調(diào)控細(xì)胞行為和功能研究方面取得了令人矚目的研究進(jìn)展。RADA16是自我互補(bǔ)的兩親性多肽，單元序列為(［COCH3］－RADARADARADARADA－［COCH2］)，由極性氨基酸(精氨酸和天冬氨酸)與非極性氨基酸(丙氨酸)交替排列，分子之間間隔的A形成疏水面，R和D形成親水面。自組裝成納米纖維的過(guò)程成形成β折疊結(jié)構(gòu)，在親水面往復(fù)形成且補(bǔ)離子鍵組裝為納米纖維，這種多肽水凝膠支架材料在體內(nèi)不會(huì)引起明顯的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)［8］。

來(lái)自層粘連蛋白的IKVAV序列具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)及分化等功能［9］，可以與神經(jīng)干細(xì)胞表面的IKVAV受體LBP110發(fā)揮作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)直接固相法在RADA16的羧基末端修飾IKVAV模體合成RADA16－IKVAV，將自組裝多肽RADA16與多肽RADA16－IKVAV混合制備功能化自組裝多肽水凝膠，根據(jù)各種因子在干細(xì)胞定向分化過(guò)程中的不同作用，選擇了預(yù)誘導(dǎo)劑(bFGF和EGF)及定向誘導(dǎo)劑(SHH+ RA)，將BMSCs與水凝膠混合培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)功能化自組裝多肽水凝膠能促進(jìn)BMSCs遷移，提高其向神經(jīng)元分化的比例，MAP2陽(yáng)性細(xì)胞百分率、功能標(biāo)志ChAT和VAT陽(yáng)性表達(dá)實(shí)驗(yàn)組明顯優(yōu)于對(duì)照組，表明我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建的自組裝多肽凝膠對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有良好細(xì)胞相容性，特定因子合適的配伍及時(shí)序應(yīng)用可以使骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外向膽堿能神經(jīng)元分化，為臨床中脊髓損傷的神經(jīng)修復(fù)提供客觀理論依據(jù)。

［1］闞瑞，涂來(lái)勇，楊明坤，等.神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合體外自組裝IKVAV納米纖維凝膠移植治療大鼠脊髓損傷［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2013，93(21):1669～1673.

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［3］王天瑞，馬學(xué)曉，于騰波，等.人工合成IKVAV多肽對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和Neurocan基因表達(dá)的影響［J］.脊柱外科雜志，2012，10(2):109～112.

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Directed Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells in the Functional Differentiation of Self－assembling Peptide Hydrogel

LI Pengbin， CHE Biao， ZHANG Zhenxing， et al
(General Hospital of the Yangtze River Shipping，Hubei Wuhan430010，China)

Objective:To investigate the potential and differentiation of bone marrow stromal cells which in functional self－assembling peptide hydrogel after directed differentiation for neural cells functional characteristics.Method:The functionalized self－assembling peptide was produced by mixing the self－assembling peptide RADA16 and peptide RADA16－IKVAV.BMSCs were seeded into RADA16 self－assembling peptide hydrogel(control group)and functionalized self－assembling peptide hydrogel(experimental group)surface.Pre－inducing agents with bFGF and EGF and directed inducers(SHH+RA)induced timing，application Nestin，after MAP2，GFAP，ChAT，VAT immunofluorescence staining to detect morphological and functional differentiation of neural－like cells mark.Result:By inducing BMSCs in functional self－assembling peptide hydrogel culture and inducers communist specific combination and timing of the proliferation and differentiation of neuronal cells exhibit like change，MAP2－positive cells was significantly increased compared with the control group(P＜0.05)，GFAP－positive cells the percentage was significantly lower than the control group(P＜0.05)，and the feature flag ChAT，VAT expressed only in the experimental group.Conclusion:BMSCs in the function of self－assembling peptide hydrogels can be induced into neural cells have certain features.

Hydrogel; Bone marrow stromal cells; Self－assembling peptide; Neural cell

A

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.04.004

1006－6233(2015)04－0539－04

交通運(yùn)輸部長(zhǎng)江航務(wù)管理局科技項(xiàng)目基金，(編號(hào):201210010)

＊＊ 通訊作者