王慧娟　馮社軍　李軍濤　武艷強

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

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丙泊酚對LPS誘導的大鼠急性肺損傷狀態(tài)下SP-B表達的調(diào)節(jié)作用*

王慧娟馮社軍李軍濤武艷強

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

【摘要】目的探討丙泊酚對LPS誘導的大鼠急性肺損傷的保護作用和對肺組織肺表面活性蛋白B(SP-B)的調(diào)節(jié)作用。方法30只雄性Wistar大鼠(SPF級)隨機分為對照組(Control組)、治療組(LPS+Propofol組)和模型組(LPS組)每組10只。通過頸靜脈注射LPS建立大鼠急性肺損傷(ALI)模型。采用HE染色觀察肺組織病理學改變并進行肺損傷評分；采用濕/干比(W/D)值分析肺水腫嚴重程度；使用RT-PCR和western blotting對肺組織中SP-B的表達進行檢測。結(jié)果在給予頸靜脈注射LPS后，大鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理改變和較高的肺損傷評分，W/D值明顯升高，同時肺組織中SP-B mRNA和蛋白水平明顯降低，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但與LPS組相比較，LPS+Propofol組大鼠肺組織病理變化較輕，肺損傷評分和W/D值較低，同時肺組織中SP-B mRNA和蛋白的表達水平較高，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論鎮(zhèn)靜藥丙泊酚可以有效改善大鼠ALI導致的肺部炎癥反應和肺水腫，同時上調(diào)肺組織中SP-B的表達水平。但仍需進一步研究揭示丙泊酚對于ALI狀態(tài)下SP-B的調(diào)節(jié)作用的分子機制和相關的信號通路。

【關鍵詞】丙泊酚； 急性肺損傷； 急性呼吸窘迫綜合征； 肺表面活性蛋白B

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是一個疾病的連續(xù)兩個不同階段，其實質(zhì)是各種嚴重的急性肺內(nèi)和肺外病因包括重癥肺炎、嚴重膿毒血癥和重癥胰腺炎等導致的肺部的自我放大的和失控的炎癥反應[1~4]。肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant, PS)是維持肺順應性和肺內(nèi)液體平衡的重要物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)在ALI/ARDS狀態(tài)下PS的表達明顯降低，且與ALI/ARDS的嚴重程度密切相關[5, 6]。目前多個研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚(propofol)具有抑制炎癥反應和氧化應激的作用，同時還有研究證實丙泊酚對炎癥狀態(tài)下的肺上皮細胞具有保護作用[7~10]。本實驗的目的是探討在ALI狀態(tài)下丙泊酚對肺組織的保護作用和對肺表面活性蛋白B (surfactant protein B, SP-B)的調(diào)節(jié)作用。

1材料和方法

1.1主要材料30只雄性Wistar大鼠(SPF級，6~8周，體重約180~220g)購于四川大學實驗動物中心，分籠飼養(yǎng)，自由飲水與攝食。電泳單元及電泳附件、電源、濕轉(zhuǎn)式電轉(zhuǎn)儀和凝膠成像系統(tǒng)由Bio-rad公司提供。大腸埃稀桿菌內(nèi)毒素(LPS)購自美國Sigma公司。聚合酶鏈反應(PCR)引物由上海生物工程技術服務有限公司合成?？俁NA抽提試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，第一鏈cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒購自美國Mbi Fermentas公司，SP-B和β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2方法

1.2.1動物模型建立30只健康雄性Wistar大鼠隨機平均分為對照組(Control組)、治療組(LPS+propofol組)和模型組(LPS組)，每組10只。腹腔注射戊巴比妥(40mg/Kg)麻醉大鼠。治療組和模型組大鼠通過頸靜脈注射LPS (5mg/Kg)誘導建立ALI模型。對照組給予生理鹽水代替LPS。在LPS干預前30min和干預后30min，分別對治療組大鼠以6mg/kg/min持續(xù)泵入丙泊酚(樂維靜，四川國瑞藥業(yè)有限責任公司) 5min，共2次[8]。LPS干預6h后處死大鼠，獲取肺組織備用。

1.2.2HE染色觀察病理變化并進行肺損傷評分取右下肺組織，常規(guī)制成5μm的石蠟切片，HE染色觀察肺損傷程度，并進行肺損傷評分[7]。評分標準如下：①肺泡充血。②出血。③肺泡腔或血管腔中性粒細胞浸潤或聚集。④肺泡壁增厚和(或)透明膜形成四項指標，分別依病變輕重評0~4分(0：無病變或非常輕微；1：輕度病變；2：中度病變；3：重度病變；4：極重度病變)。各項評定分數(shù)相加為ALI總評分[4]。血液離心后吸取血漿，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3肺組織濕/干比(wet to dry ratio, W/D)測定大鼠處死后取出肺部組織。將樣本置于80℃烤箱24h至恒重后，記錄前后肺組織重量，計算W/D值。

1.2.4RT-PCR法檢測SP-B mRNA表達取左下葉肺組織，按照試劑盒說明書提取總RNA。以2μg總RNA為模板，用Oligo (dT)18作為引物，按照試劑盒說明書介紹要求合成cDNA第1鏈。SP-B正義5′-GAGGATATTGTCCACCTCCT -3′，反義5′-ATAGCCTGTTCACTGGTGT -3′；β-actin引物：正義：5′-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3′，反義：5′-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3′，PCR反應體系如下：2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物模板、PCR Master Mix (2×) 25μl、正反引物各2μl，以超純水補充至50μl。應用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影，Quantity One軟件對目的條帶進行掃描分析。用SP-B/β-actin PCR產(chǎn)物條帶灰度比值作為SP-B mRNA的相對表達量。

1.2.5Western blot法檢測肺組織蛋白表達首先提取肺組織總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入兔抗鼠單克隆抗體磷酸化SP-B (1∶ 800)和β-actin (1∶ 5000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。

2結(jié)果

2.1肺組織病理變化肺組織切片進行HE染色后光鏡下觀察。對照組(Control組)：肺組織未見炎性細胞浸潤，肺泡間隔均勻無增寬，肺泡結(jié)構清晰，無紅細胞和透明膜形成，為正常肺組織。模型組(LPS組)：肺組織存在大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔中大量水腫液，并可見較多紅細胞進入肺泡腔，肺泡腔中可見透明膜形成。治療組(LPS+Propofol組)：肺組織中存在炎癥細胞浸潤但較模型組明顯減少，肺泡間隔輕度增寬，肺泡中少量紅細胞和水腫液聚集，可見肺間質(zhì)肺水腫。模型組大鼠肺組織損傷評分明顯高于治療組(P<0.05)，見圖1、表1。

表1　三組大鼠肺組織損傷評分和W/D值±s)

注：與Control組比較①P<0.05，與LPS組比較②P<0.05

2.2肺組織SP-B表達水平采用RT-PCR和western blotting對肺組織中SP-B mRNA和蛋白水平進行檢測。在經(jīng)頸靜脈注射LPS 6h后，大鼠肺組織中SP-B mRNA和蛋白水平均明顯下降(P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)，LPS+Propofol組大鼠肺組織中SP-B表達水平較LPS組明顯增加(P<0.05)，見圖2、表2。

表2　三組大鼠肺組織SP-B mRNA和蛋白的表達水平

注：與Control組相比較，①P<0.05，與LPS組相比較②P<0.05

圖1三組大鼠肺組織病理變化(HE染色，×200倍)

Figure 1The pathological changes in each group (HE staining, ×200)

圖2三組大鼠肺組織SP-B表達RT-PCR和western blotting結(jié)果

Figure 2The RT-PCR and western blotting results of SP-B in rats

3討論

急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是一個疾病連續(xù)的兩個階段。各種嚴重的急性肺內(nèi)和肺外病因包括重癥肺炎、嚴重膿毒血癥和重癥胰腺炎等導致的肺部的自我放大的和失控的炎癥反應是導致ALI/ARDS發(fā)生的根本原因[1~4, 11]。目前研究發(fā)現(xiàn)嚴重的肺泡上皮細胞和肺血管內(nèi)皮細胞損傷是導致ALI/ARDS直接原因[1~4, 11]。同時肺表面活性物質(zhì)(PS)對維持肺泡的穩(wěn)定性和肺組織順應性、調(diào)節(jié)肺內(nèi)液體平衡以及調(diào)節(jié)肺組織固有免疫和炎癥反應均有重要的作用[5, 6]。PS的減少是ALI/ARDS重要的病理生理學改變之一。

PS作為一種大分子聚合物，化學成分非常復雜。PS主要由Ⅱ肺泡上皮細胞合成和分泌，包括磷脂和蛋白兩部分，其他還包括糖脂和中性脂質(zhì)。二棕櫚酸磷脂酰膽堿(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC)是PS中降低肺泡表面張力的最主要物質(zhì)。表面活性物質(zhì)相關蛋白(surfactant-associated protein, SP)包括4種，即SP-A、SP-B、SP-C和SP-D，其中SP-A和SP-D為親水性蛋白；SP-B和SP-C為疏水性蛋白[5, 6, 12~14]。目前研究認為在ALI/ARDS狀態(tài)下PS的減少與肺容積減少，肺泡塌陷，肺組織順應性下降，高通透性肺水腫和氧合功能障礙等密切相關[12~14]?；A實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)若能夠上調(diào)PS成分的表達或外源性給予PS可有效的改善ARDS的病理變化、臨床癥狀以及患者預后[12~14]。

SP-B是PS重要的蛋白成分。SP-B基因首先經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯成約為42 kDa的單體前蛋白原，再經(jīng)過修飾后形成成熟的SP-B同二聚體。SP-B可促進肺泡表面磷脂的吸附，具有維持肺泡完整性和氣-液表面單分子層的穩(wěn)定性降低肺泡表面張力的作用。管狀髓磷脂由PS成分有機結(jié)合構成，是PS功能的基礎，SP-B是管狀髓磷脂形成的必需成分。同時研究證實SP-B還具有抑制肺部炎癥反應的作用[14, 15]。研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)PS組SP-A、SP-B和DPPC等的表達，對ALI/ARDS有保護作用[14, 15]。目前多個研究發(fā)現(xiàn)在多種病理狀態(tài)下，丙泊酚(propofol)具有抑制炎癥反應和氧化應激的作用[7~10]。同時還有研究證實丙泊酚對炎癥狀態(tài)下的肺上皮細胞具有保護作用[8]。

我們研究發(fā)現(xiàn)在給予大鼠頸靜脈注射LPS 6h后，大鼠肺組織出現(xiàn)顯著的病理學改變包括大量炎癥細胞浸潤，明顯的肺泡間隔增寬，肺泡腔中大量水腫液，并可見較多紅細胞進入肺泡腔，肺泡腔中可見透明膜形成等(見圖1)。但給予丙泊酚干預的大鼠病理改變明顯較模型組減輕。且進行肺損傷評分證實LPS+Propofol組大鼠評分較LPS組大鼠明顯降低(表1)。肺泡上皮細胞和肺血管內(nèi)皮細胞損傷導致的高通透性肺水腫是ARDS特征性改變之一。嚴重的肺水腫可直接導致有效肺容積降低，肺泡順應性下降和氧合功能障礙，是導致ARDS患者早期死亡的重要原因[2]。本試驗中我們使用肺濕/干比(wet to dry ratio, W/D)對各組肺組織水腫程度進行分析，發(fā)現(xiàn)LPS干預后大鼠肺組織W/D顯著增加，但LPS+Propofol組大鼠W/D較LPS組較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明丙泊酚可以有效的抑制LPS誘導的大鼠ALI肺部炎癥反應和肺水腫，對大鼠肺組織有保護作用。

進一步采用RT-PCR和western blotting法對SP-B mRNA和蛋白表達進行分析后發(fā)現(xiàn)LPS干預后大鼠肺組織SP-B表達水平顯著降低(P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)，與LPS組相比較LPS+Propofol組大鼠肺組織中SP-B表達明顯增加(P<0.05) (圖2、表2)。該結(jié)果表明丙泊酚可有效上調(diào)大鼠ALI狀態(tài)下肺組織SP-B的表達水平。

4結(jié)論

本實驗研究表明丙泊酚能有效減輕LPS誘導大鼠ALI導致的肺部炎癥反應和高通透性肺水腫，并可能與上調(diào)SP-B的表達密切相關。但仍需進一步的研究揭示丙泊酚調(diào)節(jié)SP-B的分子機制和相關的信號通路。

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Propofol enhances surfactant protein B in LPS-induced acute lung injury in rats

WANG Hui-juan，F(xiàn)ENG She-jun，LI Jun-tao,etal

(HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of propofol on the expression of surfactant protein B (SP-B) in LPS-induced acute lung injury (ALI) in rats. Methods30 male Wistar rats were randomly divided into Control group, LPS+Propofol group and LPS group. HE staining and lug injury scores system were performed to analyze the pathological changes in lung. Wet to dry ratio (W/D) was used to detect the degree of lung edema. RT-PCR and western blotting were used to measure the expression of SP-B in lung. ResultsAfter 6h LPS injection, severe pathological changes, raised W/D, and reduction of SP-B in lung were observed. Nevertheless, compared with LPS group, pathological changes, lung injury scores and W/D were significantly attenuated. Meanwhile, SP-B expression was markedly promoted by propofol treatment. ConclusionOur data show that propofol enhanced the expression of SP-B in a rat model of LPS induced ALI.

【Key words】Propofol; Acute lung injury; acute respiratory distress syndrome; Surfactant protein B

(收稿日期：2014-04-14； 編輯： 陳舟貴)

通訊作者：李軍濤,E-mail：lijuntao2014@163.com

基金項目：河北省衛(wèi)生廳重點科研計劃(20130359)

【中圖分類號】R 563.8

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.01.003