徐 聰，劉乃國(guó)，毛 寧，劉云啟

(1. 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256603；2. 濱州醫(yī)學(xué)院，山東 濱州 256600)

PDGF-C、PDGF-D在大鼠腎間質(zhì)纖維化過程中的作用

徐 聰1，劉乃國(guó)2，毛 寧2，劉云啟1

(1. 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256603；2. 濱州醫(yī)學(xué)院，山東 濱州 256600)

目的 探討血小板源性生長(zhǎng)因子-C(PDGF-C)、血小板源性生長(zhǎng)因子-D(PDGF-D)在大鼠腎間質(zhì)纖維化模型中的表達(dá)及意義。方法 將28只SD大鼠按照單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)的方法建模，分別于造模后的3 d、1周、2周、3周分別將7只大鼠處死，取出兩側(cè)腎臟(未行手術(shù)側(cè)的腎臟設(shè)為對(duì)照組)制作石蠟切片在光鏡下觀察。應(yīng)用免疫組化(SABC)法檢測(cè)模型大鼠腎組織中PDGF-C、PDGF-D的表達(dá)情況。結(jié)果 對(duì)照組中PDGF-C在腎小動(dòng)脈的血管平滑肌細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中少量表達(dá)，PDGF-D主要在血管平滑肌細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)。而模型組腎臟中PDGF-C、PDGF-D的表達(dá)顯著上調(diào)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，且腎間質(zhì)及腎小管中PDGF-C、PDGF-D的表達(dá)強(qiáng)度與腎間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)(r=0.73，P<0.05；r=0.67，P<0.05)。結(jié)論 PDGF-C、PDGF-D均參與腎間質(zhì)纖維化過程，并可能發(fā)揮著重要作用。

腎間質(zhì)纖維化；PDGF-C；PDGF-D；單側(cè)輸尿管梗阻模型

腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮是多種原因?qū)е履I間質(zhì)損傷的共同結(jié)局，其過程是復(fù)雜的，包括多種獨(dú)立和相互作用的細(xì)胞和分子途徑。參與腎間質(zhì)纖維化過程的細(xì)胞包括腎小管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞，分子介質(zhì)包括肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)等，它們之間的作用機(jī)制至今尚未闡明。本研究用SD大鼠，采用單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)的方法建立腎間質(zhì)纖維化的模型，檢測(cè)腎組織中PDGF-C、PDGF-D的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討二者在腎間質(zhì)纖維化中的作用，加深對(duì)腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制的了解。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1主要試劑 兔抗PDGF-C多克隆抗體、兔抗PDGF-D多克隆抗體(abcam 公司)；生物素化山羊抗兔IgG、SABC及DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2動(dòng)物及造模方法 選擇清潔級(jí)雄性SD大鼠28只，體質(zhì)量180～230 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(魯)2011-0003。將大鼠用3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉(劑量為0.15 mL/kg)，后行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)(于背部肋脊角處切開皮膚，長(zhǎng)約2 cm，取出腎臟，將其翻向脊柱側(cè)，以濕紗布覆蓋，暴露腎門，分離輸尿管，用手術(shù)線上下結(jié)扎2次，中間剪斷輸尿管。提起切口處皮膚肌肉，使腎臟回納原位，依次縫合肌肉、皮下組織及皮膚)，分別于3 d、1周、2周和3周后隨機(jī)選擇7只大鼠，取其雙側(cè)腎組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。未手術(shù)側(cè)腎臟作為對(duì)照組。

1.3腎小管間質(zhì)纖維化評(píng)分方法 將組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，按照Banff分級(jí)[1]在光鏡下對(duì)腎間質(zhì)纖維化病變程度進(jìn)行半定量評(píng)分，分為0～3分。腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小管及腎間質(zhì)未見明顯改變計(jì)為0分；腎小管上皮細(xì)胞輕度萎縮、變性，纖維組織增生呈小灶性、少量分布，病變范圍<25%計(jì)為1分；腎小管上皮細(xì)胞中度萎縮、變性、壞死輕，纖維組織中度增生，病變范圍26%～50%計(jì)為2分；腎小管上皮細(xì)胞重度萎縮、變性和壞死重，成片分布，纖維組織增生呈束狀、網(wǎng)狀成片，病變范圍>50%計(jì)為3分。觀察10個(gè)不重復(fù)的高倍視野，取其平均值作為結(jié)果。

1.4腎組織檢測(cè) 用免疫組化(SABC)法檢測(cè)PDGF-C及PDGF-D在腎組織中的表達(dá)情況。切片常規(guī)脫水，滅活內(nèi)源性酶，修復(fù)抗原， BSA封閉液封閉，分別滴加兔抗PDGF-C多克隆抗體、兔抗PDGF-D多克隆抗體培育過夜，山羊抗兔IgG，SABC反應(yīng)30 min,DAB顯色(顯微鏡下控制顯色時(shí)間)，蘇木素復(fù)染；脫水、透明、封片，每一步完成后均用PBS緩沖液沖洗3次。

1.5結(jié)果判斷 組織上染上棕褐色為PDGF-C、PDGF-D陽性，采用計(jì)算機(jī)彩色病理圖像分析軟件對(duì)PDGF-C、PDGF-D免疫組化進(jìn)行半定量分析，具體操作：分別取10個(gè)不重復(fù)的腎小管間質(zhì)視野(顯微鏡200倍)，以視野面積中陽性面積的比例計(jì)算，通過半定量分析后取其平均值作為結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1病理學(xué)改變 光鏡下，對(duì)照組大鼠腎臟腎小球、腎小管無明顯病理改變，未見腎間質(zhì)纖維化，腎間質(zhì)纖維化程度評(píng)分為(0.2±0.1)分；UUO術(shù)后3 d大鼠腎臟腎小管輕微萎縮，未見明顯的腎間質(zhì)纖維化，腎間質(zhì)纖維化程度評(píng)分為(0.3±0.1)分；UUO術(shù)后7 d大鼠腎臟可見腎小管輕度萎縮，少量腎間質(zhì)纖維組織增生，腎間質(zhì)纖維化程度評(píng)分為(1.3±0.2)分；UUO術(shù)后14 d大鼠腎臟可見腎小管上皮細(xì)胞萎縮、變性，腎間質(zhì)纖維組織增生多灶狀分布，腎間質(zhì)纖維化程度評(píng)分為(1.7±0.3)分；UUO術(shù)后21 d大鼠腎臟可見較多腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，腎間質(zhì)纖維化組織增生樹狀分布，腎間質(zhì)纖維化程度評(píng)分為(2.3±0.2)分。

2.2PDGF-C在腎組織中的表達(dá)情況 在對(duì)照組，PDGF-C僅在腎臟小動(dòng)脈的血管平滑肌細(xì)胞和少數(shù)的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)，見圖1；UUO模型組小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞以及腎間質(zhì)及腎小管中都有PDGF-C，見圖2～5；而且隨著模型建立后時(shí)間的延長(zhǎng)，PDGF-C在腎間質(zhì)及腎小管中的含量升高，與對(duì)照組相比，PDGF-C在模型組腎臟中的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見表1。PDGF-C在小管間質(zhì)的陽性表達(dá)與腎小管間質(zhì)纖維化積分呈正相關(guān)(r=0.73,P<0.05)。

表1 不同時(shí)間段各組PDGF-C陽性表達(dá)面積占小管間質(zhì)總面積

注：①與對(duì)照組相比,P<0.05。

2.3PDGF-D在腎組織中的表達(dá)情況 在對(duì)照組，PDGF-D主要表達(dá)在血管平滑肌細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞，在腎間質(zhì)中無表達(dá)，見圖6。UUO模型組，PDGF-D不僅在上述細(xì)胞中表達(dá)增多，也表達(dá)在間質(zhì)纖維化區(qū)域的間質(zhì)細(xì)胞中；而且隨著模型建立后時(shí)間的延長(zhǎng)，PDGF-D在腎間質(zhì)中的含量逐漸升高，見圖7～10。PDGF-D在小管間質(zhì)的陽性表達(dá)與腎小管間質(zhì)纖維化積分呈正相關(guān)(r=0.67,P<0.05)。見表2。

表2 2組不同時(shí)間段PDGF-D陽性表達(dá)面積占小管間質(zhì)總面積

注：①與對(duì)照組相比,P<0.05。

圖1 PDGF-C在對(duì)照組大鼠腎臟中的表達(dá)(DAB×400)

圖2 PDGF-C在UUO 3 d大鼠腎臟中的表達(dá)(DAB×400)

圖3 PDGF-C在UUO 7 d大鼠腎臟中的表達(dá)(DAB×400)

圖4 PDGF-C在UUO 14 d大鼠腎臟中的表達(dá)(DAB×400)

圖5 PDGF-C在UUO 21 d大鼠腎臟中的表達(dá)(DAB×400)

圖6 PDGF-D在對(duì)照組大鼠腎臟中的表達(dá)(DAB×400)

圖7 PDGF-D在UUO 3 d大鼠腎臟中的表達(dá)(DAB×400)

圖8 PDGF-D在UUO 7 d大鼠腎臟中的表達(dá)(DAB×400)

圖9 PDGF-D在UUO 14 d大鼠腎臟中的表達(dá)(DAB×400)

圖10 PDGF-D在UUO 21 d大鼠腎臟中的表達(dá)(DAB×400)

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病發(fā)展的共同途徑，多種生長(zhǎng)因子參與其中。大量研究表明，PDGF家族可刺激系膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的積聚[2-3]，在腎間質(zhì)纖維化過程中起著重要作用。UUO模型是目前比較理想的腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型之一，與人類腎間質(zhì)纖維化過程相近[4]，故本研究采用UUO模型，對(duì)腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。

PDGF家族包括PDGF-A，PDGF-B，PDGF-C，PDGF-D 4個(gè)成員，其所有成員均通過兩個(gè)受體(PDGF-α、PDGF-β)發(fā)揮作用，并組成性或誘導(dǎo)性地表達(dá)于腎臟細(xì)胞，參與細(xì)胞增殖和遷移及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積累，親和抗炎遞質(zhì)分泌的調(diào)節(jié)，在調(diào)解系膜增生改變及腎間質(zhì)纖維化和腎小球血管生成中扮演著重要的角色[5-7]。

PDGF-C、PDGF-D是PDGF家族新發(fā)現(xiàn)的2個(gè)特殊亞型，它們有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是C-末端的PDGF / VEGF結(jié)構(gòu)域和N-末端的CUB結(jié)構(gòu)域。它們主要由肥大細(xì)胞分泌，在胚胎發(fā)育和成人組織中均具有重要的功能。在胚胎發(fā)育過程中，PDGF-C在心、耳、腦及腎臟的生長(zhǎng)過程中扮演著重要的角色；在成人中，腎臟和腦組織中含有較多的PDGF-C。PDGF調(diào)節(jié)多種病理生理活動(dòng)，從細(xì)胞增殖、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)積聚，產(chǎn)生親和抗炎遞質(zhì)，到組織滲透性和血流動(dòng)力學(xué)。在心、肝、肺纖維化模型中均檢測(cè)到了PDGF-C的過度表達(dá)[8-9]。

腎間質(zhì)纖維化是多種細(xì)胞及分子參與的復(fù)雜的過程，PDGF-C是腎臟最典型的生長(zhǎng)因子系統(tǒng)，越來越多的證據(jù)表明PDGF家族是腎臟纖維化發(fā)展的關(guān)鍵因素[10]。Gilbertson等[11]證實(shí)PDGF-C通過它的受體發(fā)揮作用，其可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞有絲分裂。PDGF-C的其他功能還包括刺激血管的生成和促進(jìn)傷口的愈合[12]。正常組織中，PDGF-C mRNA只在腎小球壁層上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，但在損傷組織中，PDGF-C在腎小管和腎間質(zhì)中的表達(dá)明顯上調(diào)，可能和腎纖維化的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。而在腎纖維化過程中，PDGF-C誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞趨化因子的表達(dá)，刺激成纖維細(xì)胞增生、上皮細(xì)胞遷移及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[13-15]，加重腎臟的炎癥和纖維化。本實(shí)驗(yàn)說明，PDGF-C在正常大鼠腎組織中少量表達(dá)，但隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，部分腎小管萎縮、變性、壞死，腎間質(zhì)纖維組織增生，PDGF-C的表達(dá)增多，且其表達(dá)水平與腎間質(zhì)的纖維化程度呈正相關(guān)，進(jìn)一步表明PDGF-C可能參與了腎間質(zhì)纖維化的過程且扮演著重要的角色。

PDGF-D是一種新型的腎小球系膜細(xì)胞增殖的介質(zhì)[16]。PDGF-D與PDGF-B均通過PDGF β發(fā)揮作用，因此他們具有類似的生物學(xué)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)研究將腺病毒結(jié)構(gòu)編碼的PDGF-D注入小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示血清中含有高水平PDGF-D的小鼠發(fā)展為嚴(yán)重的系膜增生性腎小球腎炎，這項(xiàng)研究為證實(shí)PDGF-D是一種腎小球系膜細(xì)胞有絲分裂原提供了有利依據(jù)[13]。Taneda等[17]的一項(xiàng)研究證實(shí)在UUO大鼠模型中，PDGF-D的表達(dá)在腎間質(zhì)細(xì)胞迅速增加。PDGF-D表達(dá)區(qū)域與β受體上調(diào)區(qū)域緊密重疊，這表明PDGF-D通過其受體發(fā)揮促纖維化作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在正常腎臟中PDGF-D主要表達(dá)在血管平滑肌細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞中。而UUO模型組，隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，PDGF-D不但在上述細(xì)胞中的表達(dá)增多，也表達(dá)在間質(zhì)纖維化區(qū)域的間質(zhì)細(xì)胞中，其陽性表達(dá)面積與腎間質(zhì)纖維化的程度呈正相關(guān)。這表明PDGF-D參與腎間質(zhì)纖維化并扮演著重要的角色。Ostendorf等[18]實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗PDGF-D治療可以降低腎皮質(zhì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。Boor等[19]和Eisel等[20]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗PDGF-D治療在維持腎功能方面具有長(zhǎng)遠(yuǎn)意義，能更好地保護(hù)腎臟的形態(tài)。

慢性腎臟疾病的主要病變之一是腎間質(zhì)的纖維化及腎小球的硬化，盡早防止這種改變，對(duì)預(yù)防終末期腎病的發(fā)生意義重大。PDGF-C及PDGF-D在腎間質(zhì)纖維化中起著重要的作用，因此，抗PDGF-C、PDGF-D靶向治療有望成為今后治療腎間質(zhì)纖維化的研究熱點(diǎn)。

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Role of PDGF-C and PDGF-D in renal tubulointerstitial fibrosis in rats

XU Cong1, LIU Naiguo2, MAO Ning2, LIU Yunqi1

(1.The Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256603, Shandong, China; 2.Binzhou Medical University, Binzhou 256600, Shandong, China)

Objective It is to investigate the expression of PDGF-C and PDGF-D in rat models of renal tubulointerstitial fibrosis and its significance. Methods 28 SD rats were made into models of renal tubulointerstitial fibrosis by one-side unilateral ureteral obstruction (UUO), 7 rats were killed at 3 7 14 and 21 days after surgery to get the kidneys in both side (the kidney not operated as control group) to make kidney specimen for the observation under light microscope, and expression of PDGF-C and PDGF-D in kidney were determined by immunohistochemistry. Results In the kidneys in control group, PDGF-C was found to be normally expressed in vascular smooth muscle cells of small arteries and within individual tubular cells, PDGF-D was expressed in vascular smooth muscle cells and glomerular mesangial cells. After UUO, renal PDGF-C and PDGF-D protein was significantly overexpressed as compared with healthy normal control kidneys(P<0.05), the expression of PDGF-C and PDGF-D in tubulointerstitium were positively correlated with the development of renal interstitial fibrosis (r=0.73,P<0.05;r=0.67,P<0.05). Conclusion PDGF-C and PDGF-D may play an important role in the development and progression of tubulointerstitial fibrosis.

renal interstitial fibrosis； PDGF-C； PDGF-D； models of one-side unilateral ureteral obstruction

徐聰，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槟I臟病學(xué)的基礎(chǔ)與臨床研究。

劉云啟，E-mail：liuyunqi@medmail.com.cn

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.02.006

R-332

A

1008-8849(2015)02-0132-05

2014-06-05