楊金玲 江 陽 薛 勇 孫成均△

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院， 山東 濟(jì)寧 272067；2四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都 610041)

超聲分散液相微萃取-氣相色譜法同時測定食品中11種防腐劑*

楊金玲1,2江 陽2薛 勇2孫成均2△

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院， 山東 濟(jì)寧 272067；2四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都 610041)

目的 建立食品中11種防腐劑的超聲分散液相微萃取-氣相色譜法。方法 樣品經(jīng)9∶1二氯甲烷-乙酸乙酯超聲分散液相微萃取，F(xiàn)FAP毛細(xì)管色譜柱分離、FID檢測器檢測。結(jié)果 方法線性范圍為0.068～400μg/ml，相關(guān)系數(shù)為0.9990～0.9999，回收率為84%～122%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.11%～5.83%，方法檢出限為0.026～0.23μg/ml。結(jié)論 該法簡便、高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好，適于不同食品中11種防腐劑同時快速測定。

超聲分散液相微萃??；氣相色譜法；食品；防腐劑

苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸酯類等防腐劑在食品行業(yè)應(yīng)用十分廣泛，但有的企業(yè)濫用防腐劑，對消費(fèi)者健康帶來潛在危害，所以，我國對食品防腐劑的使用進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定[1-3]。目前，國內(nèi)外報(bào)道的方法主要有氣相色譜法[4-7]、高效液相色譜法[8-9]等，但側(cè)重多組分定性篩檢或少量組分定量研究,且樣品處理方法以常規(guī)液液萃取和固相萃取為主。液液萃取消耗有機(jī)溶劑較多；固相萃取柱成本高，操作繁瑣。

超聲輔助分散液相微萃取(DLLME)[3，6]是一種微型化的液液萃取，不加分散劑，利用超聲波的強(qiáng)化擴(kuò)散和乳化效應(yīng)，加速待測組分在兩相間分散。集采樣、萃取和濃縮于一體，操作簡單快速、成本低、富集效率高，對環(huán)境友好。為加大食品安全監(jiān)管力度，需建立簡便快速同時測定多種防腐劑的方法。本文首次采用蒽為內(nèi)標(biāo)物，以微量二氯甲烷-乙酸乙酯為混合提取溶劑，采用超聲分散液相微萃取-氣相色譜法，只需簡單樣品處理即可同時測定不同基質(zhì)食品中11種防腐劑，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent6890N氣相色譜儀；高速離心機(jī)；超聲波清洗器。富馬酸二甲酯(DMF)與2-苯基苯酚(OPP)均購于德國Augsburg公司；脫氫乙酸(DHA)購于美國Chemservice公司；苯甲酸甲酯(MEB)、苯甲醇(BEA)、山梨酸(SA)、苯甲酸(BA)、對羥基苯甲酸甲酯(MEP)、對羥基苯甲酸乙酯(ETP)、對羥基苯甲酸丙酯(PRP)、對羥基苯甲酸丁酯(BUP)均購于中國天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，蒽購于日本和光制藥。各物質(zhì)含量均大于99.5%。二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、氯化鈉、鹽酸均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ.cm)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)20.0mg分別置于10ml容量瓶中，用二氯甲烷-乙酸乙酯(9∶1，簡稱DEA溶劑)定容，配成濃度均為2.00mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；準(zhǔn)確稱取蒽10.0mg置于10ml容量瓶中，用DEA溶劑定容，配成濃度為1.00mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液；分別吸取一定量各儲備液，用DEA溶劑逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為12.5～200μg/ml(富馬酸二甲酯與2-苯基苯酚)和25～400μg/ml(苯甲酸甲酯、苯甲醇、山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸酯類)的混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。

1.3 色譜條件

色譜柱為FFAP柱(澳大利亞SGE公司，25 m×0.32 mm×0.25μm)；進(jìn)樣口溫度為270 ℃，分流比10∶1。初始溫度130℃，保持3.5min；以30℃/min速率升至230℃，保持9.5min。流速3.0ml/min；FID檢測器溫度為270℃，尾吹流量30ml/min。載氣為氮?dú)?純度99.999%)，氫氣與空氣流速分別為35ml/min和400ml/min。進(jìn)樣量1μL。

1.4 樣品制備

固體和半固體樣品經(jīng)攪碎混勻后，準(zhǔn)確稱取0.5g左右，加入內(nèi)標(biāo)物蒽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10ml (100μg)，用水定容至25ml，超聲2min，備用。液體樣品定容后無需超聲，其他操作同固體樣品。

1.5 超聲分散液相微萃取

取1ml樣液于 2ml具塞玻璃離心管中，加入少量濃鹽酸調(diào)溶液pH 3.0，再加0.35g NaCl，振搖至完全溶解。加入100μl DEA溶劑，超聲3min，室溫下8000rpm離心2min。取1μl進(jìn)樣分析。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別進(jìn)樣1μl混合標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)用液，各組分分離完全，見圖1。

圖1 11種防腐劑與內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

1.7 結(jié)果計(jì)算

進(jìn)樣液中被測物含量由內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得，再由下式計(jì)算樣品中待測組分含量：

式中：C為進(jìn)樣液中由內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的待測組分含量(μg/ml)；V為萃取劑體積(ml)；W為樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取溶劑及用量選擇 根據(jù)待測組分的極性與溶解性特征，比較了單獨(dú)使用100μL三氯甲烷、二氯甲烷及100μL不同比例的二氯甲烷、三氯甲烷與乙酸乙酯和正丁醇分別混合對待測組分的萃取效果。結(jié)果見圖2。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用三氯甲烷或二氯甲烷時，回收率均低于50%。二氯甲烷、三氯甲烷與乙酸乙酯混合萃取效果均優(yōu)于與正丁醇混合，各組分回收率為80%～122%。這可能與正丁醇的沸點(diǎn)明顯高于其他溶劑有關(guān)。由于二氯甲烷毒性低于三氯甲烷，故選擇二氯甲烷-乙酸乙酯做萃取溶劑，并進(jìn)行了5∶1，7∶1，9∶1，11∶1的溶劑配比實(shí)驗(yàn)，混合溶劑密度分別為1.123，1.276，1.287，1.294g/ml。結(jié)果表明，使用9∶1的二氯甲烷-乙酸乙酯時，既可以得到穩(wěn)定的分散體系，可在下層收集到約80%的有機(jī)相，且待測組分的響應(yīng)值最高。故選擇9∶1的二氯甲烷-乙酸乙酯作為萃取溶劑。

實(shí)驗(yàn)考察了萃取劑為50～200μl對萃取效果的影響。結(jié)果表明，萃取劑為150～200μL時，得到的有機(jī)相較多，但相應(yīng)有機(jī)相中組分濃度低。萃取劑為50μl時，得到的有機(jī)相過少，收集困難。故選擇萃取劑用量為100μl。

圖2 二氯甲烷-乙酸乙酯比例對萃取效果的影響

2.1.2 pH值影響 實(shí)驗(yàn)表明，在pH≥10的堿性條件下，酯類防腐劑的回收率均低于30%，這可能與酯被水解有關(guān)。考察了溶液pH值為1～9時對萃取效果的影響(圖3)。

圖3 pH值對萃取效果的影響

由圖3可見，在pH=1或9時酯類的萃取量顯著低于pH=3或6。這可能與酯類在強(qiáng)酸或堿性條件下不穩(wěn)定有關(guān)。酸類組分的峰面積隨pH值增大而減小，當(dāng)pH值=9時，山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸與苯甲醇、2-苯基苯酚的峰面積迅速減小，這是由于酸類組分在水溶液中以離子態(tài)存在，酸化后才可以轉(zhuǎn)化為分子態(tài)易被萃取。而苯甲醇、2-苯基苯酚在堿性條件下性質(zhì)不穩(wěn)定。當(dāng)pH =3.0時，各組分的萃取量均較高，精密度好，故選擇pH= 3.0。

2.1.3 鹽效應(yīng)影響 已有文獻(xiàn)[4]報(bào)道，當(dāng)溶液中無機(jī)鹽濃度增大時，有機(jī)溶劑與水的互溶比改變，組分在水中的溶解度降低。實(shí)驗(yàn)考察了不同NaCl濃度對萃取效果的影響，結(jié)果表明，隨氯化鈉濃度增加，富馬酸二甲酯、苯甲酸甲酯、苯甲醇、山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯的萃取量逐漸增大，2-苯基苯酚、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯的萃取量卻減小，這說明不同組分受氯化鈉的影響不同。當(dāng)在1ml溶液中加入0.35g氯化鈉時，各組分相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%，回收率為80%～120%。但加入NaCl<0.17g時，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差>11%，回收率為60%～150%。故選擇氯化鈉用量為0.35g。

2.1.4 超聲時間影響 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲時間不同時，形成的體系渾濁程度不同。于是考察了超聲時間為1～7min對萃取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3min時各組分的萃取量基本達(dá)到最大值。

2.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

為消除樣品處理和測定過程對定量帶來的誤差，采用內(nèi)標(biāo)法定量。由于蒽的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)與待測組分接近，保留時間位于酸、醇、酚與酯類防腐劑之間，且樣品中不含蒽，故選擇蒽為內(nèi)標(biāo)。

2.3 方法性能指標(biāo)

2.3.1 方法線性范圍、檢出限、定量下限和精密度 方法檢出限以3倍信噪比計(jì)算；方法定量下限以10倍信噪比計(jì)算。見表1。

2.3.2 選擇可樂、月餅、火腿、榨菜和白醋等不同基質(zhì)樣品，加入高中低不同水平標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。見表2。

表1 方法的回歸方程、檢出限、定量下限和精密度

表2 方法回收率(%，n=3)

3 方法應(yīng)用

應(yīng)用本法對78個食品樣品進(jìn)行了檢測，其中47個樣品檢出防腐劑，總檢出率為60.2%。有3個樣品同時檢出多種防腐劑。其中，苯甲酸檢出率為59.6%；山梨酸檢出率為25.5%；脫氫乙酸檢出率21.3%。所檢糕點(diǎn)樣品中防腐劑以脫氫乙酸為主，飲料樣品中防腐劑以苯甲酸為主，在白醋中檢出對羥基苯甲酸乙酯，在糕點(diǎn)、飲料、火腿、調(diào)料與腌漬類食品中均有山梨酸檢出，在白醋中檢出對羥基苯甲酸乙酯。而在10種水果樣品中均未檢出防腐劑。

志謝：本課題得到濟(jì)寧市科技局項(xiàng)目《市銷預(yù)包裝食品中重金屬與防腐劑的調(diào)查分析》(項(xiàng)目編號2013jnwk61)和濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目《濟(jì)寧市預(yù)包裝食品中防腐劑與重金屬的檢測及分析》(項(xiàng)目編號：JY2013KJ028)資助，特此志謝！

[1] GB 2760-2011，食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2] GB/T5009.121-2003，食品中脫氫乙酸的測定[S].

[3] GB/T 5009.29-2003，食品中山梨酸、苯甲酸的測定[S].

[4] Farajzadeh M A,Djozan D J,Bakhtiyari R F.Use of a capillary tube for collecting an extraction solvent lighter than water after dispersive liquid-liquid microextraction and its application in the determination of parabens in different samples by gas chromatography-flame ionization detection[J].Talanta,2010,81(2):1360-1367.

[5] Wang L L,Zhang X,Wang Y P,et al.Simultaneous determination of preservatives in soft drinks,yogurts and sauces by a novel solid-phase extraction element and thermal desorption-gas chromatography[J].Anal Chim Acta,2006,577(6):62-67.

[6] Dong C Z,Wang W F.Headspace solid-phase microextraction applied to the simultaneous determination of sorbic and benzoic acids in beverages[J].Anal Chim Acta,2006,562(2):23-29.

[7] 楊金玲,江陽,薛勇,等.毛細(xì)管氣相色譜法快速測定飲料中10種防腐劑[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013,36(2):127-129.

[8] Ganzera M,Aberham A,Stuppner H.Development and validation of an HPLC/UV/MS method for simultaneous determination of 18 preservatives in grapefruit seed extract[J].Food Chem,2006,54(11):3768-3772.

[9] Li X P,Chao J,Sun Y Y.Analysis of synthetic antioxidants and preservatives in edible vegetable oil by HPLC/TOF-MS[J].Food Chem,2009,113(7):692-700.

Simultaneous determination of eleven preservatives in food by capillary column-gas chromatography after ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction

YANGJinling，JIANGYang，XUEYong，SUNChengjun

(Institute of forensic Medicine and Laboratory Medicine,Jining Medical University,Jining 272067,China)

ObjectiveTo establish a method for simultaneous determination of eleven preservatives in foods by gas chromatography after ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction.MethodsThe target preservatives in food samples were ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextracted,and then they were separated with FFAP capillary column and detected with FID detector.ResultsLinear ranges of the method were between 0.068 and 400μg/mL with correlation coefficients varying from 0.9990 to 0.9999.Recoveries and relative standard deviations (RSDs)were in the range from 84% to 122% and from 3.11% to 5.83%,respectively.The limitation of detection was in the range form 0.026μg/ml to 0.23μg/ml with enrichment factors ranging from 57 to 225 for all target compounds.ConclusionThe method is simple,efficient,cheap,eco-friendly and is suitable for simultaneous determination of 11 preservatives in different foods.

Ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction;Gas chromatography；Food;Preservatives

* [基金項(xiàng)目]2013濟(jì)寧市科技局項(xiàng)目(編號：13jnwk61)；2013濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目(編號:JY2013KJ028)

10.3969/j.issn.1000-9760.2015.01.013

R155.5

A

1000-9760(2015)02-047-05

2015-01-15)

△ [通信作者]孫成均，E-mail:sunchj2002@163.com