許建平,鐘國權(quán)(廣東省河源市源城人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 517000)

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乙型肝炎病毒核苷類藥物耐藥突變和基因型研究

許建平,鐘國權(quán)(廣東省河源市源城人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 517000)

目的 研究聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)(PCR-LDR)檢測乙型肝炎(下稱乙肝)病毒核苷類藥物耐藥位點(diǎn)和基因型的可行性。方法 運(yùn)用多重LDR和PCR原理，在乙肝病毒基因相關(guān)區(qū)域設(shè)計引物和探針檢測突變位點(diǎn)和基因型。結(jié)果 156例臨床樣本中，B型占60.90%(95/156),C型占37.20%(58/156),非B非C型占1.90%(3/156)。此外共檢出56例樣本存在突變，其中拉米夫定耐藥突變41例。結(jié)論 本研究顯示拉米夫定耐藥突變主要在rtM204I/V和rtL180M，阿德福韋以rtN236T/rtA181V為主;恩替卡韋一般聯(lián)合拉米夫定耐藥，并且發(fā)生耐藥突變以B型為多。

耐藥； 突變； 基因型

根據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查表明，我國乙型肝炎(下稱乙肝)病毒(HBV)攜帶者達(dá)到1億人左右，其中慢性乙肝患者超過2 000萬人。HBV持續(xù)感染與肝炎、肝硬化、肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。目前，臨床長期廣泛使用核苷類藥物，該類藥物長期使用,會使慢性乙肝患者體內(nèi)HBV出現(xiàn)不同程度對核苷類藥物耐藥突變。此外，HBV基因型是病毒長期變異進(jìn)化的結(jié)果，不同基因型反映了HBV變異進(jìn)化特點(diǎn)，并且與肝病臨床表現(xiàn)、預(yù)后存在一定相關(guān)性。聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)(PCR-LDR)是一種最新的單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測方法，PCR-LDR可通過一次擴(kuò)增檢測產(chǎn)物中的多個突變位點(diǎn)[1-6]。本研究通過該方法檢測HBV常見耐藥突變和基因型，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究標(biāo)本取自2012年3月至2014年3月廣東省河源地區(qū)156例慢性乙肝患者，均符合2000年肝炎防治會議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男98例,女58 例，年齡26～69歲，平均46.5歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集慢性乙型肝炎患者空腹不抗凝靜脈血5 mL,2 500 r/min離心10 min,分離血漿至專用血漿保存管，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取 使用Qiagen DNA Mini Kit試劑盒(德國),按照試劑說明書從200 mL血漿中提取血漿HBV DNA。

1.2.3 主要試劑 乙肝耐藥和分型檢測試劑盒購自上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司,其中TaqDNA ligase酶和dNTP來自上海英俊，Taq酶來自大連寶生物公司。PCR引物和LDR探針和序列見表1。

1.2.4 主要儀器 ABI3130 DNA測序儀(美國ABI公司)，MJ2000 PCR儀(美國Agilent公司)。

1.2.5 PCR和LDR擴(kuò)增體系和條件 PCR擴(kuò)增體積50 μL體系，包括10 μL PCR緩沖溶液,10 pmol引物2 μL，2 U DNA聚合酶(TaKaRa)，5 μL HBV DNA模板,補(bǔ)充蒸餾水至50 μL。PE9600 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 60 s，循環(huán)40次，然后72 ℃延伸10 min。LDR反應(yīng)20 μL體系,包括2 μL PCR緩沖溶液，3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,1 U DNA連接酶,補(bǔ)充蒸餾水至20 μL進(jìn)行LDR,95 ℃變性2 min，95 ℃ 30 s和65 ℃ 2 min，循環(huán)25次。2.5 μL LDR產(chǎn)品與上樣緩沖液等體積混合。將混合物在94 ℃持續(xù)2 min變性，急速冷凍。然后ABI3130 DNA測序儀電泳30 min。結(jié)果采用GeneMapper4.0軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HBV基因型結(jié)果 156例 HBV基因型分別為：B型60.90%(94/156),C型37.20%(64/156),非B非C型1.90%(3/156)。HBV基因型以B型為主。在各基因型中均可檢出耐藥基因突變，基因型B型和C型中耐藥基因突變差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.157，P>0.05),見表2。

表1 HBV基因PCR引物和LDR探針序列

注：-表示無數(shù)據(jù)。

表2 不同基因型核苷類藥物耐藥基因發(fā)生例數(shù)(n)

2.2 HBV基因突變結(jié)果 在156例樣本中共56例檢出耐藥，占33.98%(56/156)。4種核苷類藥物耐藥基因檢出率各異，41例檢出rtM204I及其混合突變，為拉米夫定(LAM)耐藥,占75.00%(42/56)。單一點(diǎn)突變32.14(18/56),多耐藥突變67.86(38/56)，其中檢出5例拉米夫定/替比夫定(LDT)/阿德福韋(ADV)共同耐藥。見表3。

表3 34例不同核苷類藥物耐藥基因突變位點(diǎn)分析

注：ETV為恩替卡韋。

2.3 PCR-LDR方法驗(yàn)證 從56例HBV 耐藥變異樣本中隨機(jī)挑選20例,PCR擴(kuò)增后送上海英俊公司測序,所得測序結(jié)果在DNA star軟件上比對,19例測序結(jié)果與PCR-LDR耐藥變異一致,1例測序結(jié)果沒有變異，PCR-LDR與金標(biāo)法測序一致性為95%。本方法通過檢測丙型肝炎病毒樣本、人巨細(xì)胞病毒樣本等非HBV樣本，所得結(jié)果均為陰性，特異性為100%。

3 討 論

對于HBV核苷酸類似物耐藥的檢測，歐美國家多采用IN-NO-LIPA方法，其靈敏度和特異性都比較高，但試劑盒非常昂貴，在我國尚難推廣普及。目前國內(nèi)檢測HBV基因耐藥變異的方法主要有以下幾種，各有優(yōu)缺點(diǎn)。實(shí)時PCR操作簡便，可檢測變異發(fā)生率低于10%的耐藥變異。缺點(diǎn)為僅能檢測已知位點(diǎn)，同樣難以實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)行多個耐藥突變位點(diǎn)檢測；同時，針對每個位點(diǎn)不同變異均需合成相應(yīng)的探針。隨著耐藥位點(diǎn)增多，相應(yīng)合成探針的費(fèi)用增高。PCR產(chǎn)物直接測序:PCR產(chǎn)物直接測序法可檢測已知和可能的未知耐藥變異位點(diǎn)，是最常用的基因型耐藥檢測方法之一。PCR產(chǎn)物直接測序的方法應(yīng)作為基因型耐藥檢測的金標(biāo)準(zhǔn),該方法的缺點(diǎn)是靈敏度較差，只有當(dāng)變異株超過HBV準(zhǔn)種池的20%時才能被發(fā)現(xiàn)。

PCR-LDR是一種新興的單SNP分型檢測方法。其原理是高溫連接酶檢測到模板DNA與2條探針DNA的接頭處存在堿基錯配，則連接反應(yīng)不能進(jìn)行；即如果探針與模板有1個堿基不配對，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，如果探針與模板完全互補(bǔ)，連接反應(yīng)完成。與其他檢測技術(shù)相比，LDR檢測技術(shù)擁有準(zhǔn)確度高、通用性強(qiáng)、通量大、操作簡單、成本低等眾多明顯優(yōu)勢[6]。

本研究結(jié)果顯示,河源地區(qū)HBV基因B型占60.90%,C型占37.20%,非B非C型占1.90%,與左興等[7]廣東地區(qū)HBV基因型(62.00%為B型,33.00%為C型)基本一致。LAM耐藥突變目前報道發(fā)現(xiàn)的與LAM相關(guān)的主要耐藥突變有rtM204V、rtM204I和rtL180M，其他突變位點(diǎn)有rtL80V/I、rtI169T、rtV173L等;ADV相關(guān)的耐藥突變多為多點(diǎn)突變，目前得到學(xué)界公認(rèn)的主要耐藥位點(diǎn)有rtA181T、rtA181V和rtN236T;ETV的耐藥變異需要在rtM204+rtL180位突變的基礎(chǔ)上，再聯(lián)合rtT184、rtS202、rtM250和rtI169位點(diǎn)上一個或多個氨基酸突變;LDT主要與M204I變異相關(guān)[8-12]。本研究結(jié)果顯示，LAM耐藥突變主要在rtM204I/V和rtL180M,LDT耐藥突變與LAM相同，沒有檢測到其他突變位點(diǎn)。ADV以rtN236T/rtA181V為主;ETV一般聯(lián)合LAM耐藥，并且發(fā)生耐藥突變以B型為多。

本研究與金標(biāo)法測序進(jìn)行比對，二者一致性達(dá)到95%，1例PCR-LDR陽性樣本測序陰性，通過第3種方法RealTime-PCR檢測為陽性變異，通過相對定量估測其突變比率在10%左右，說明該樣本測序陰性主要是靈敏度較低造成的。PCR-LDR在檢測丙型肝炎病毒、人巨細(xì)胞病毒等非HBV樣本時均為陰性，特異性達(dá)到100%。以上驗(yàn)證說明該方法的準(zhǔn)確性和特異性均達(dá)到高值[9-10]。

目前報道了核苷類藥物的一部分耐藥位點(diǎn)，但新的耐藥突變位點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，而目前應(yīng)用于臨床的、可全面反映基因耐藥情況、有效指導(dǎo)臨床藥物選擇的檢測方法十分有限。本研究采用簡便和快速的PCR-LDR檢測HBV基因型和核苷類藥物耐藥基因突變位點(diǎn)，較現(xiàn)有方法具有明顯優(yōu)勢。因此，在現(xiàn)有HBV基因耐藥突變研究的基礎(chǔ)上，建立起適合臨床的全面檢測HBV耐藥突變的新技術(shù)，制訂更加合理的抗病毒治療方案，對可能耐藥的患者進(jìn)行相關(guān)耐藥方面的檢測，及時調(diào)整治療方案，具有非常重要的臨床意義。

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Study on nucleoside analogue-resistant mutataion and genotyes in hepatitis B virus

XUJian-ping，ZHONGGuo-quan

(DepartmentofClinicalLaboratory,YuanchengPeople′sHospital,Heyuan,Guangdong517000,China)

Objective To study the feasibility of PCR-LDR assay for detedting nucleoside analogue resistant loci and genotypes of hepatitis B virus (HBV).Methods The multiplex LDR and PCR principle was used to design primers and probes in the HBV related regions for detecting mutation loci and genotypes.Results 156 clinical samples,B type accounted for 60.90% (95/156),C type accounted for 37.20% (58/156);non-B non-C type accounted for 1.90% (3/156).Further 56 samples of mutations were detected,in which 41 cases were lamivudine-resistant mutations.Conclusion This study shows that lamivudine resistance mutations are mainly in rtM204I/V and rtL180M,adefovir resistance is dominated by rtN236T/rtA181V;entecavir plus lamivudine are resistant in general.And the occurrence of resistant mutations is mainly B-type.

resistance; mutation; genotype

許建平,男,本科,主管技師,主要從事病原微生物臨床檢驗(yàn)方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.024

A

1672-9455(2015)09-1240-03

2014-11-01

2015-01-28)