陳 鑫，韓 霜，臧素綱，宣世海，汪曉鶯，周玉貴△(.南通大學(xué)附屬東臺醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇東臺 400;.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，江蘇南通 600)

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血清miR-375表達(dá)及臨床應(yīng)用*

陳 鑫1，韓 霜1，臧素綱1，宣世海1，汪曉鶯2，周玉貴1△(1.南通大學(xué)附屬東臺醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇東臺 224200;2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，江蘇南通 226001)

目的 建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測血清miR-375，并進(jìn)行臨床初步應(yīng)用。方法 用Trizol試劑提取血清總RNA。miR-375ploy(A)聚合酶加尾逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增檢測。制作C.elegans-miR-39模擬物濃度梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線，絕對定量血清中miR-375的表達(dá)水平。結(jié)果 該方法能定量檢測血清miR-375表達(dá)水平，熔解曲線呈單峰，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異，在103～106copy/μL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(r2=0.997)，并且檢測重復(fù)性好。糖尿病患者血清中miR-375表達(dá)水平明顯高于健康體檢者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR能敏感、特異地檢測血清中miR-375的表達(dá)水平，為下一步臨床應(yīng)用研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)； miR-375； 糖尿病

microRNAs(miRNAs)廣泛存在于真核生物中，是一類參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子單鏈RNA。成熟的miRNAs通過與其互補(bǔ)的靶mRNA堿基配對結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)，不僅參與機(jī)體細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、增殖、代謝、凋亡等一系列生理活動(dòng)的調(diào)控，而且在多種疾病的病理過程中發(fā)揮重要作用[1-4]。病變組織miRNAs的表達(dá)水平顯著異常于正常組織，呈現(xiàn)高度組織特異性，可以直接反映機(jī)體的病理狀況。在胰腺和胰島β細(xì)胞中表達(dá)的眾多miRNAs中，miR-375不僅參與調(diào)控胰島素的合成和分泌，還在胰島的發(fā)育過程中發(fā)揮作用，提示與糖尿病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[5-7]。因而，對miR-375的研究具有非常重要的科研意義和應(yīng)用前景。據(jù)此，本文建立了ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測miR-375的方法，通過此種方法檢測血清標(biāo)本中miR-375的表達(dá)水平，初步探討其對糖尿病診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年6月至2013年6月南通大學(xué)附屬東臺醫(yī)院經(jīng)WHO(1999年)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的糖尿病患者118例，其中男59例，女59例，年齡26～88歲，病程數(shù)月到數(shù)年不等。另選擇同期健康體檢者106例，其中男52例，女54例，年齡28～84歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 樣本采集 所有研究對象于清晨空腹采集靜脈血3～5 mL。分離血清后分裝至-80 ℃恒溫冰箱保存。

1.3 主要試劑與儀器 Trizol溶解試劑、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、Taq DNA聚合酶、內(nèi)含SYBR Green Ⅰ熒光染料的PCR緩沖液、焦炭酸二乙酯(DEPC)、TAE緩沖液、溴化乙錠、離心管(南通碧云天技術(shù)研究所)，無水乙醇、氯仿、異丙醇(無錫展望化工試劑有限公司)，100 bp DNA Ladder Marker(大連寶生物工程有限公司)。Rotor Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀(德國Qiagen公司)、HC-2518R型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、SMA1000微量紫外分光光度計(jì)(北京美林恒通公司)、DYY-III8A型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀(北京六一儀器廠)、DH-2000凝膠成像系統(tǒng)(北京華電公司)、BSC-1500ⅡA2X型生物安全柜(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)。

1.4 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)miRBASE(http://www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫中Hsa-miR-375(UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA)序列，設(shè)計(jì)其特異性poly(A)加尾逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增引物。線蟲C.elegans-miR-39模擬物、內(nèi)參miR-15a及其引物均由德國Qiagen公司設(shè)計(jì)合成。

1.5 血清總RNA提取 取200 μL復(fù)溶的血清于離心管中，加入Trizol溶解試劑，充分混勻裂解；之后分別用氯仿、異丙醇及DEPC處理水配制的乙醇，并結(jié)合硅膠膜特異性吸附作用來分離和純化RNA。RNA從離心管硅膠膜上洗脫溶于DEPC處理水中。通過測定計(jì)算RNA溶液260 nm和280 nm的紫外吸收值比值(A260/A280)確認(rèn)RNA濃度和純度。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反應(yīng)體系體積為20 μL，包括總RNA樣本、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、DEPC處理水。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得的cDNA于-80 ℃保存。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系體積為20 μL，包括miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA、dNTP混合物、miR-375上游特異引物、下游通用引物、Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液(內(nèi)含SYBR Green Ⅰ熒光染料)、DEPC處理水。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以同樣的反應(yīng)體系和Hsa-miR-15a特異性引物進(jìn)行內(nèi)參Hsa-miR-15a熒光定量。以DEPC處理水代替逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為陰性對照。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將人工合成的C.elegans-miR-39的miRNA模擬物以DEPC處理水稀釋8個(gè)數(shù)量級，即101、102、103、104、105、106、107及108copy/μL，分別取每一數(shù)量級稀釋液2 μL與待測標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增檢測，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。擴(kuò)增后根據(jù)擴(kuò)增曲線設(shè)定統(tǒng)一閾值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及每個(gè)濃度對應(yīng)的循環(huán)閾值(Ct)平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣本Ct值計(jì)算出該血清標(biāo)本miR-375的絕對濃度，為絕對定量法。

1.9 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 配制2%的瓊脂糖凝膠，加入溴化乙錠(EB)溶液至終濃度0.5 μg/mL，80 V恒壓電泳40 min，待溴酚藍(lán)到2/3位置處停止電泳，紫外燈下觀察產(chǎn)物的有無及大小。

2 結(jié) 果

2.1 血清總RNA抽提及純度檢測結(jié)果 經(jīng)測量計(jì)算，所有標(biāo)本提取RNA溶液的A260/A280比值(1.916±0.089)均在1.8～2.1內(nèi)，由此表明RNA純度較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 熔解曲線及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳驗(yàn)證 見圖1。由圖1可見，熔解曲線呈單峰，未見雜峰信號，熔解溫度約為77 ℃。表明逆轉(zhuǎn)錄PCR參數(shù)選擇適當(dāng)，產(chǎn)物特異性較好。poly(A)聚合酶加尾法逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為85～87 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳，可見明亮、清晰的電泳條帶，與理想大小一致，見圖2。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線

圖2 逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 熒光定量PCR的檢測重復(fù)性試驗(yàn) 任取1份糖尿病患者血清標(biāo)本的RNA抽提溶液，在1次熒光定量PCR中設(shè)置10個(gè)平行孔進(jìn)行檢測，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(CV)。結(jié)果顯示，miR-375的拷貝數(shù)為(2.77±0.06)×103copy/μL，批內(nèi)CV為2.16%。對同1份標(biāo)本連續(xù)進(jìn)行10次熒光定量PCR檢測，計(jì)算批間CV。結(jié)果顯示，miR-375的拷貝數(shù)為(2.75±0.14)×103copy/μL，批間CV為5.13%。

2.4 檢測miR-375時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線 見圖3。由圖3可見，檢測標(biāo)準(zhǔn)品C.elegans-miR-39模擬物的擴(kuò)增曲線呈S型。在103～106copy/μL范圍內(nèi)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度呈良好線性關(guān)系，r2=0.997，制作成標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖3 103～106 copy/μL梯度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線

2.5 miR-375在糖尿病患者及健康體檢者血清中檢測結(jié)果比較 118例糖尿病患者和106例健康體檢者血清標(biāo)本均可見擴(kuò)增曲線，但表達(dá)程度不同，見圖5。由表1可見，糖尿病患者和健康體檢者血清中miR-375表達(dá)水平分別為(3.40±2.37)×103copy/μL和(1.11±0.67)×103copy/μL，糖尿病患者血清miR-375的表達(dá)水平高于健康體檢者。經(jīng)Mann-whitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 兩組血清miR-375表達(dá)情況

3 討 論

近年來，miRNAs在機(jī)體生理、病理過程中的重要調(diào)控作用受到廣泛關(guān)注，逐漸成為醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一。miR-375是胰島組織特異性miRNAs。研究發(fā)現(xiàn)，胰島中高表達(dá)的miR-375可以抑制胰島β細(xì)胞合成和分泌，同時(shí)miR-375還參與胰島發(fā)育過程的調(diào)控[5-7]。這就為糖尿病基因診斷的研究提供了新的切入點(diǎn)。

miRNAs的檢測技術(shù)不僅包括傳統(tǒng)的表達(dá)文庫克隆、Northern blot和熒光定量PCR，還包括新近發(fā)展起來的基因芯片技術(shù)、高通量測序技術(shù)等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR因其敏感、特異、快速，已逐漸成為最常用且有效的定量檢測方法[8]。目前，miRNAs檢測的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR主要是基于莖環(huán)的RT-PCR和基于poly(A)加尾的RT-PCR[9-10]。這兩種方法均可采用Taqman探針或SYBR熒光染料，前者特異性更高，但費(fèi)用昂貴；后者通用性好，適合于推廣開展。

本研究采用poly(A)聚合酶加尾逆轉(zhuǎn)錄和SYBR Green Ⅰ熒光染料標(biāo)記技術(shù)，建立了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血清中miR-375表達(dá)水平的方法。熔解曲線峰值單一，擴(kuò)增曲線呈典型S型，顯示基本沒有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的形成，結(jié)果可靠。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，也可見明亮清晰的電泳條帶，并且與理論大小一致，由此證明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好。以人工合成的C.elegans-miR-39miRNA模擬物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，為絕對定量法，這與目前使用較多的相對定量法不同[11-12]。在103～106copy/μL范圍內(nèi)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度呈良好線性關(guān)系(r2=0.997)，反映其能精確定量檢測血清中miR-375的表達(dá)水平。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，批內(nèi)CV為2.16%，批間CV為5.13%，由此表明該方法具有很好的穩(wěn)定性。由此可見，本研究建立的檢測方法可用于臨床檢測血清中miR-375的表達(dá)水平。通過分析定量檢測數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，118例糖尿病患者血清中miR-375表達(dá)水平明顯高于106例健康體檢者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這一結(jié)果不僅與基礎(chǔ)研究的文獻(xiàn)[5-7]報(bào)道相符合，而且與梁國威等[12]和Kong 等[13]采用其他方法對血清miR-375表達(dá)水平的檢測結(jié)果也一致。

綜上所述，本研究建立的ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-375是一種快速、有效、靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性好的方法，易于臨床實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用，有助于對miR-375在糖尿病中的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行深入研究。

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Real-time fluorescence quantitative PCR for detecting expression of serum miR-375 and its clinical application*

CHENXin1,HANShuang1,ZANGSu-gang1,XUANShi-hai1,WANGXiao-ying2,ZHOUYu-gui1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedDontaiHospitalofNantongUniversity,Dongtai,Jiangsu224200,China;2.DepartmentofImmunology,MedicalCollegeofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China)

Objective To establish a method of SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)by poly(A)polymerase tailing for the determination of miR-375 in serum and to conduct the preliminary clinical application.Methods Total RNA was extracted from serum by Trizol reagent.miR-375 was reversely transcripted into cDNA by tailing poly(A)polymerase,and then the cDNA was amplified and detected by using SYBR Green I real-time FQ-PCR.To generate a standard curve of a dilution series of C.elegans-miR-39 mimic,and detect the expression level of miR-375 in serum quantitatively.Results The method could quantitatively detect the expression level of miR-375 in serum.The melting curve showed a single peak,the PCR amplification products were specific,a good linear relationship was showed in the range of 103-106copies/uL (r2=0.997),and the detection had good repeatability.The expression level of miR-375 in diabetic patients was significantly higher than that in healthy subjects,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion The established method of SYBR Green I FQ-PCR by poly(A)polymerase tailing can detect the expression level of serum miR-375 sensitively and specifically and lays a methodological foundation for further study on its clinical application.

SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR； miR-375； diabetes mellitus

江蘇省鹽城市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(YK20130103)。

陳鑫，男，碩士，技師，主要從事分子生物學(xué)及免疫學(xué)研究。

△通訊作者，Email:yugui_z@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.012

A

1672-9455(2015)09-1208-03

2014-11-05

2015-01-19)