車睿雯，馮 帥，馮驥良，劉巨超，呂福東，諸國華，張士杰，宋晨朝，董 昆，廖孟涵

原發(fā)性肝癌在我國發(fā)病率位居第三。世界衛(wèi)生組織把原發(fā)性肝癌分為肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）、 膽 管 細(xì) 胞 癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和肝細(xì)胞-膽管細(xì)胞混合癌（Combined hepatocellular cholangiocarcinoma，HCC-ICC）[1]。原發(fā)性肝透明細(xì)胞癌（Primary clear cell carcinoma of the liver，PCCCL）被列為肝細(xì)胞系起源的一個特殊類型癌[2，3]。由于胞質(zhì)內(nèi)含有大量的糖原物質(zhì)，在HE染色下胞漿呈透明而命名[4，5]。以往文獻報道，PCCCL的分化程度較好，惡性程度低，預(yù)后較好[6-9]，而在臨床實踐中我們發(fā)現(xiàn)，部分PCCCL患者雖然為小肝癌，但卻很容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。在部分PCCCL癌巢周圍通常會有多少不一的纖維性間質(zhì)，且多數(shù)表達(dá)細(xì)胞角蛋白 19（Cytokeratin 19，CK19）。近年來的研究表明，CK19的表達(dá)提示HCC的預(yù)后不良[10，11]，而CK19在PCCCL組織的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系尚不明確。本文通過對CK19在HBV相關(guān)PCCCL中表達(dá)的研究，旨在探討CK19表達(dá)與HBV相關(guān)PCCCL浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)系以及對患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2006年11月至2014年8月我院手術(shù)切除、病理學(xué)檢查確診的肝透明細(xì)胞癌76例，男性61例，女性15例；年齡38～81歲，平均年齡為（57.3±9.4）歲。所有入組病例血清HBsAg陽性?；颊咭话闱闆r良好，無明顯心、肺、腎等重要臟器器質(zhì)性病變，肝功能正常，或Child-Pugh分級為A級或B級。排除HCV感染者。將透明細(xì)胞成分占到所有腫瘤細(xì)胞50%以上作為診斷PCCCL的最低標(biāo)準(zhǔn)。所有病例在手術(shù)或活檢前未行任何治療。血管侵犯包括大體所見和鏡下發(fā)現(xiàn)。依據(jù)手術(shù)標(biāo)本檢查和CT、磁共振成像或PET-CT檢查結(jié)果判斷腫瘤大小、局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。根據(jù)第四版消化系統(tǒng)腫瘤WHO分類進行臨床和病理學(xué)分級[12]，其中Ⅰ期、Ⅱ期62例；Ⅲ期、Ⅳ期14例。

1.2 肝組織蛋白檢測 采用SP法，兔抗人CK19、p53、GPC-3、CD34和 HepPar-1單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。取肝穿或手術(shù)標(biāo)本，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。3%H2O2孵育10 min，加血清封閉液室溫孵育10 min，分別加入兔抗人 CK19、p53、GPC-3、CD34或 HepPar-1單克隆抗體，4℃過夜，PBS洗3次。加人兔二步法檢測試劑盒（PV6001），37℃孵育 30 min，PBS洗 3次，DAB顯色，取蒸餾水1 ml和試劑盒中ABC試劑各一滴，混合后加至切片，室溫顯色至陽性呈棕黃色，鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水洗滌，中止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。用與特異性抗體種屬相同的動物正常血清代替一抗作為陰性對照。設(shè)正常膽管和肝細(xì)胞分別作為CK19和HepPar-1陽性對照，正常血管作為CD34陽性對照，以往GPC-3表達(dá)陽性的HCC組織作為GPC-3陽性對照。判定標(biāo)準(zhǔn)：陰性：腫瘤細(xì)胞無著色，或陽性信號定位不明確；陽性：腫瘤細(xì)胞有彌漫或散在陽性顆粒，CK19定位于胞漿和胞膜，HepPar-1、GPC-3和CD34定位于胞漿，P53定位于胞核。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（）表示，采用 Student’s t檢驗，對非正態(tài)分布的兩獨立樣本的計量資料行Wilcoxon秩和檢驗，計數(shù)資料采用x2檢驗和Pearson相關(guān)分析。應(yīng)用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗行生存分析。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，即以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCCCL組織形態(tài)學(xué)特點 在40例手術(shù)標(biāo)本和36例肝穿刺標(biāo)本中，組織學(xué)呈實體型53例（69.7%）和梁狀型23例（30.3%）。實體型PCCCL細(xì)胞巢之間具有狹窄的血竇樣結(jié)構(gòu)（圖1b），但不如梁狀型PCCCL組織血竇樣結(jié)構(gòu)寬大（圖1a）。大多數(shù)PCCCL組織腫瘤細(xì)胞小于正常肝細(xì)胞或與正常肝細(xì)胞大小相當(dāng)。多數(shù)細(xì)胞核位于中央，胞漿透亮（圖1b）。

圖1 肝透明細(xì)胞癌組織學(xué)表現(xiàn)（HE，200×）

2.2 肝癌組織 CK19、GPC-3、Hep par1和 CD34表達(dá)情況 在CK19陽性的PCCCL組織中，腫瘤細(xì)胞排列呈巢狀或梁狀。CK19陽性信號位于胞漿或胞膜?？拷籂罱Y(jié)構(gòu)邊緣的CK19陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)量多于中心部分（圖2a）；腫瘤細(xì)胞巢內(nèi)GPC-3呈彌漫陽性表達(dá)（圖2b）；Hep par1在CK19陽性PCCCL組織中為散在或呈巢狀分布（圖2c）。檢測CD34結(jié)果顯示，腫瘤組織血竇不豐富，肝竇樣結(jié)構(gòu)發(fā)生血管化（圖2d）。CK19陰性的PCCCL組織中可見癌周反應(yīng)性增生的膽管細(xì)胞呈CK19陽性表達(dá)（圖3a）；HepPar-1呈巢狀或片狀分布；GPC-3在腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)彌漫性表達(dá)（圖3b）；由于胞漿內(nèi)豐富的糖原，HepPar-1陽性信號在透明細(xì)胞內(nèi)多局限于近胞膜的胞漿內(nèi)（圖3c）；檢測CD34顯示腫瘤具有豐富的血竇樣結(jié)構(gòu)（圖3d）。

圖2 實體型肝透明細(xì)胞癌組織蛋白檢測情況（SP，200×）

圖3 CK19陰性透明細(xì)胞癌組織蛋白檢測情況（SP，200×）

2.3 CK19陽性和陰性PCCCL患者年齡、性別和TNM分級情況 見表1。

表1 CK19陽性與陰性PCCCL患者年齡、性別和TNM分級比較

2.4 CK19陽性與陰性PCCCL患者血清AFP水平比較 見表2。

表2 CK19陽性與陰性患者血清AFP水平比較

2.5 CK19陽性與陰性PCCCL癌組織P53蛋白表達(dá)情況 在CK19陽性和陰性PCCCL組織中均可見P53蛋白陽性表達(dá)（圖4a和圖4b，表3）。

圖4 腫瘤組織P53蛋白表達(dá)情況 （SP,200×）

表3 CK19陽性與陰性腫瘤組織P53蛋白表達(dá)情況（%）

2.6 CK19表達(dá)與PCCCL患者預(yù)后情況分析 見 表4、表5。

表4 CK19陽性與陰性患者（小于3 cm）腫瘤特征（%）比較

表5 CK19陽性與陰性患者（大于3 cm）腫瘤特征（%）比較

2.7 CK19表達(dá)與PCCCL患者生存期的關(guān)系 經(jīng)Kaplan-Meier生存分析顯示，PCCCL腫瘤CK19陽性和陰性表達(dá)患者平均生存期分別為31 w和60 w，經(jīng)Log-Rank分析顯示，兩組預(yù)后情況存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），說明CK19陰性的PCCCL患者預(yù)后優(yōu)于CK19陽性的PCCCL患者（圖5）。

圖5 CK19陽性與陰性PCCCL患者生存期比較

3 討論

腫瘤分類是腫瘤診斷的最重要和基本內(nèi)容。以往對腫瘤的分類和命名一直基于組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)，PCCCL的分類和命名便是如此[13]。近十年來，一些重要的腫瘤相關(guān)分子標(biāo)志物的不斷發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的分子分型提供了重要的依據(jù)，也使我們對腫瘤的診斷和治療進入到了個體化的時代。

PCCCL是世界衛(wèi)生組織（WHO）認(rèn)可的一個肝細(xì)胞癌的細(xì)胞學(xué)亞型。以往研究表明，PCCCL普遍表達(dá)Hep par1和pCEA，而很少或不表達(dá)胚胎性蛋白AFP[14]。因此，PCCCL被認(rèn)為可能起源于分化比較成熟的肝細(xì)胞。CK19是一個膽管細(xì)胞的標(biāo)志物，但其也在肝母細(xì)胞和肝祖細(xì)胞中表達(dá)[15]。因此，雖然CK19被廣泛作為膽管細(xì)胞癌的標(biāo)志物，但形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為實體或梁狀的原發(fā)性肝臟上皮腫瘤若CK19陽性表達(dá)，則被認(rèn)為可能轉(zhuǎn)化自成體肝祖細(xì)胞[16]。本研究中，CK19陽性的PCCCL占全部PCCCL患者的11.84%。以往文獻報道，CK19陽性HCC約占全部HCC的9.5%～16.0%[17～19]。這些證據(jù)提示，肝透明細(xì)胞癌可以起源于肝臟前體細(xì)胞，也可以轉(zhuǎn)化自由肝臟前體細(xì)胞分化而來的肝細(xì)胞。GPC3和HepPar-1在肝細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)率高，是目前肝細(xì)胞癌重要的腫瘤標(biāo)志物[20]。本研究中，GPC-3在CK19陽性和陰性的PCCCL腫瘤細(xì)胞中均可見表達(dá)，而在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為高分化的PCCCL組織中,GPC-3為弱表達(dá)或不表達(dá)。GPC-3也是胚胎性蛋白，分化不成熟的肝細(xì)胞表達(dá)，而成熟的肝細(xì)胞不表達(dá)。這一結(jié)果也支持肝透明細(xì)胞癌的多種細(xì)胞學(xué)起源，而非起源于分化良好的肝細(xì)胞。HepPar1抗原是一種名為氨甲酰磷酸合成酶1（CPS1）的鳥氨酸循環(huán)酶。CPS1的表達(dá)可以從肝母細(xì)胞開始[21]，在成熟肝小葉內(nèi)分帶表達(dá)。因此，CPS1的表達(dá)是肝細(xì)胞功能性分化的標(biāo)志。本研究顯示，由于胞漿內(nèi)豐富的糖原，Hep Par1陽性信號在透明細(xì)胞內(nèi)多局限于近胞膜的胞漿內(nèi)，與CK19表達(dá)無關(guān)，不能作為PCCCL特異性的診斷標(biāo)志物。

目前，有關(guān)PCCCL患者預(yù)后的研究報道較少，也尚未達(dá)成共識。以前的大部分研究認(rèn)為，PCCCL患者的預(yù)后較非PCCCL性肝細(xì)胞癌預(yù)后好。我們的研究表明，在腫瘤直徑＜3 cm時，CK19陽性與陰性PCCCL患者多發(fā)結(jié)節(jié)、血管侵犯、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等無統(tǒng)計學(xué)差異，而在腫瘤直徑大于3 cm時，CK19陽性的PCCCL患者相對更易發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，生存期縮短。這些結(jié)果表明，對PCCCL的早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)對于患者的預(yù)后具有重要意義。肝穿活檢是一種簡單、有效、創(chuàng)傷小的定性診斷方法。但由于該方法所獲取的病變組織少，不能全面反映病變的組織學(xué)特征。在我們的肝穿活檢組織中，有5例形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為典型的PCCCL，而在回顧研究中發(fā)現(xiàn)這些病例為CK19陽性表達(dá)，且預(yù)后不良。我們建議對肝臟腫瘤手術(shù)標(biāo)本常規(guī)檢測CK19表達(dá)情況，以便更好地對患者的預(yù)后作出評估。

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