楊其容，張平安

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是發(fā)病率較高的惡性腫瘤，具有侵襲能力強(qiáng)、極易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點。肝癌細(xì)胞侵犯門靜脈系統(tǒng)，導(dǎo)致肝組織內(nèi)播散是術(shù)后疾病復(fù)發(fā)率高的原因之一[1]。相關(guān)研究證實[2，3]，肝癌侵襲周圍組織和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象主要是因為腫瘤細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）和血管基底膜（Basement membrane，BM）及腫瘤組織內(nèi)新生血管組織的形成。乙酰肝素酶（Heparanase，Hpa）是一種內(nèi)切糖苷酶，可對ECM和BM的結(jié)構(gòu)完整性造成嚴(yán)重破壞，進(jìn)而有助于腫瘤細(xì)胞順利通過ECM和血管壁，最終出現(xiàn)周圍組織侵襲和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移[4～7]。本研究檢測了HCC組織Hpa的表達(dá)情況，并分析了其與微血管密度（Microvessel density，MVD）的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 組織來源 47例原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本均取自本院2012年7月至2014年12月期間行外科手術(shù)切除的HCC患者，經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為HCC。所有患者手術(shù)治療前均未采取放化療措施，且局部淋巴結(jié)在手術(shù)治療中均得到清除。同時切除同一患者第一份癌旁肝組織（距病灶組織邊緣2 cm處）作為A組和第二份癌旁肝組織（距病灶組織邊緣>5 cm）作為B組。

1.2 試劑 Trizol試劑購自Promega公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶和dNTP均購自北京中山生物技術(shù)有限公司；Hpa上下游引物及β-actin由上海生工生物工程公司合成；抗Hpa和抗CD34兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruz公司；S-P免疫組化試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 肝癌組織Hpa蛋白和CD34表達(dá)水平檢測 將手術(shù)取出的肝癌組織置入4%多聚甲醛溶液固定、95%酒精溶液脫水及石蠟包埋，由病理科醫(yī)生制作4μm厚切片，采取免疫組織化學(xué)法（SP法）檢測Hpa蛋白和CD34表達(dá)，即組織切片經(jīng)脫臘至水，高溫修復(fù)抗原，0.3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化酶。采用羊血清封閉處理內(nèi)源性抗原，滴加抗Hpa或抗CD34兔抗人多克隆抗體（1:500）及相應(yīng)的二抗，DAB顯色，予以復(fù)染、脫水、透明及封片。以0.1%PBS溶液替代一抗作為陰性對照，已知陽性組織切片作為陽性對照。結(jié)果判斷：Hpa蛋白主要表達(dá)在肝癌細(xì)胞的胞漿中，根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)判斷陽性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度：① 陽性細(xì)胞率：0分，≤5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，>75%；② 染色強(qiáng)度：0分，無色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽性細(xì)胞率×染色強(qiáng)度≥2分表示為Hpa蛋白檢測陽性。

1.4 MVD值測定 采用抗CD34抗體對肝癌組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，在光學(xué)顯微鏡下計算單位面積內(nèi)微血管數(shù)目，即為MVD值。首先，在低倍鏡下選定最佳檢測區(qū)域，然后在200倍顯微鏡下隨機(jī)選擇4個視野，內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)免疫組化法染色呈棕黃色表現(xiàn)時計數(shù)為一個血管，而血管管腔>8個紅細(xì)胞，或血管管壁有平滑肌組織表現(xiàn)時則不作為一個血管進(jìn)行計數(shù)。其平均值即為MVD值。

1.5 各種肝組織Hpa mRNA水平檢測 采用RTPCR法檢測。稱量新鮮肝組織100 mg，完全研磨成粉末狀后轉(zhuǎn)移至勻漿器中，加入Trizol試劑1 ml，提取RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA水平。稱量總RNA 2μg，37℃逆轉(zhuǎn)錄處理60 min。PCR反應(yīng)條件為：94℃變性處理 5 min；94℃60 s，57℃60 s，72℃60 s，72℃延伸 5 min，共 30 個循環(huán)。根據(jù)已知Hpa的基因序列設(shè)計引物，上游引物：5'-TTCGAT CCCAAGAAGGAATCAAC-3'，下游引物：5'-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3'，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為 585b；β-actin上游引物：5'-ATCTGGCAC CACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3'，下游引物：5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為838 bp。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與緩沖液按1:1比例進(jìn)行混合，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用紫外凝膠成像分析系統(tǒng)（上海迪奧生物科技有限公司）掃描PCR條帶的光密度，從而獲得目的片段擴(kuò)增條帶的平均灰度值，以Hpa/β-actin比值表示Hpa mRNA的相對水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件包，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，計量資料以（）表示，采用t檢驗，對Hpa mRNA水平與MVD的相關(guān)性采用Spearman法分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床和病理學(xué)特征肝癌組織Hpa蛋白表達(dá)的比較 Hap蛋白主要定位在肝癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒狀及彌漫性片狀分布（圖1、圖2）。不同分化程度、臨床分期、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、AFP水平、有無門脈癌栓和不同腫瘤直徑癌組織中Hpa蛋白表達(dá)存在明顯的差異（P<0.05，表 1）。

2.2 各組肝組織Hpa mRNA和MVD水平 比較CD34在肝癌組織中呈彌漫性分布，而在正常肝組織肝竇內(nèi)無CD34表達(dá)，或僅在少數(shù)匯管區(qū)血管有所表達(dá)（圖3、圖4、圖5），肝癌組織Hpa mRNA和MVD水平均明顯高于A組和B組（P<0.05），而A組Hpa mRNA和MVD水平明顯高于B組（P<0.05，表 2）。

表1 不同臨床和病理學(xué)特征肝癌組織Hpa蛋白表達(dá)的比較

圖1 肝癌組織Hpa蛋白表達(dá)陽性(SP，200×)

表2 各組肝組織Hpa mRNA水平和MVD個數(shù)（）比較

表2 各組肝組織Hpa mRNA水平和MVD個數(shù)（）比較

與肝癌組織比，①P<0.05；與A組癌旁組織比，②P<0.05

例數(shù) Hpa/β-actin MVD（個）肝癌組織 47 0.793±0.184 34.5±12.2 A組癌旁組織 47 0.577±0.145① 22.2±10.7①B組癌旁組織 47 0.384±0.117①② 14.7±7.4①②

3 討論

周圍組織侵襲和遠(yuǎn)處臟器組織轉(zhuǎn)移均為惡性腫瘤疾病的病理特征，也是影響腫瘤患者治療效果和疾病預(yù)后的重要因素。腫瘤細(xì)胞對ECM和BM的侵襲破壞、新生血管組織的形成是腫瘤組織生長、轉(zhuǎn)移的重要條件，而ECM和BM主要由結(jié)構(gòu)蛋白和糖氨聚糖構(gòu)成，后者主要成分為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（Heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）[8，9]。相關(guān)研究顯示[10，12]，HSPGs在胚胎組織早期形成、形態(tài)形成、血管組織生成和上皮間質(zhì)細(xì)胞相互作用等方面均發(fā)揮極為關(guān)鍵的生理學(xué)作用。

圖2 肝癌組織Hpa蛋白表達(dá)陰性(SP，200×)

近些年，關(guān)于HCC轉(zhuǎn)移主要集中在底物為結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白酶上，而對底物為HSPGs的Hpa研究相對較少。Hpa mRNA可出現(xiàn)在脾臟、骨髓等免疫組織中，而在心肺肝腎等非免疫組織中均不存在，但可廣泛存在于惡性腫瘤組織或細(xì)胞中[13,14]。相關(guān)研究結(jié)果顯示[15]，Hpa可特異性降解HSPGs，在各種病理生理過程中均起到一定的作用，而其水平降低后誘發(fā)的效應(yīng)作用主要為[16]：①在ECM、BM降解后，阻礙癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的保護(hù)屏障系統(tǒng)也會受到嚴(yán)重?fù)p傷；②結(jié)合在Hpa上的堿性成纖維細(xì)胞生長因子大量釋放，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；③ 結(jié)合在Hpa上的uPA和tPA大量釋放，進(jìn)而活化生長因子和激活ECM中的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)。上述效應(yīng)作用在腫瘤細(xì)胞的生長增殖及周圍組織侵襲等病理過程中起著明顯的促進(jìn)作用。相關(guān)研究已證實[17]，Hpa表達(dá)與多種惡性腫瘤的生長﹑浸潤和轉(zhuǎn)移等病理現(xiàn)象均存在緊密的相關(guān)性，但其在肝癌組織中的表達(dá)研究相對較少。本研究結(jié)果顯示，Hpa蛋白在分化程度、臨床分期、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、AFP、門脈癌栓、腫瘤直徑等不同臨床病理特征方面均存在明顯的差異性（P<0.05）。轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的肝癌組織中Hpa蛋白表達(dá)陽性率明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的肝癌組織，分析原因主要是肝癌細(xì)胞破壞ECM和BM，極易突破門靜脈血管管壁，進(jìn)而沿著門靜脈屬支發(fā)生遠(yuǎn)處臟器組織轉(zhuǎn)移[18]。低分化及臨床分期高的肝癌組織Hpa蛋白表達(dá)陽性率明顯高于高分化及臨床分期低的肝癌組織，提示分化程度越低及臨床分期越高，則腫瘤組織的周圍組織侵襲力越高，可能與低分化和高臨床分期肝癌組織中Hpa蛋白表達(dá)水平較高有一定的相關(guān)性[19]。有門脈癌栓表現(xiàn)的肝癌組織Hpa蛋白表達(dá)陽性率明顯高于無門脈癌栓者，門脈癌栓是反映肝癌細(xì)胞侵襲周圍組織能力的重要特征，而肝癌細(xì)胞侵入門靜脈系統(tǒng)形成癌栓的主要原因是Hpa降解和破壞正常組織的保護(hù)屏障系統(tǒng)[20]。

腫瘤病灶組織內(nèi)新生血管組織的形成是導(dǎo)致腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移等病理過程的重要因素，分析原因是新生血管為腫瘤細(xì)胞增殖生長提供了充足的營養(yǎng)物質(zhì)，且為其周圍組織浸潤、遠(yuǎn)處臟器組織轉(zhuǎn)移提供了有效通道。MVD是反映新生血管形成及腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移等能力的有效指標(biāo)，而CD34明顯優(yōu)于其他標(biāo)記物，故本研究采用CD34標(biāo)記計算各組肝組織的MVD值[21]。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織Hpa mRNA水平及MVD值均明顯高于癌旁組織和正常肝組織，且Hpa mRNA水平與MVD值呈正相關(guān)，此結(jié)果提示Hpa可促進(jìn)腫瘤組織新生血管的形成。

綜上所述，Hpa蛋白在肝癌細(xì)胞生長增殖、周圍組織侵襲和新生血管形成等病理過程中起著關(guān)鍵性的作用，可成為臨床治療肝癌的新作用靶點。由于Hpa蛋白表達(dá)與部分肝癌臨床病理特征有一定的相關(guān)性，對指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后評估具有一定的價值。

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