許欽坤　趙翠燕

摘要：從污染土壤中，分離出1株能高度抗鎘和吸附鎘的菌株S-1，經(jīng)初步鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。對其生物學(xué)特性進行研究，結(jié)果表明，該菌株在液體細(xì)菌培養(yǎng)基中耐鎘（Cd）濃度高達600 mg/L；菌株S-1對Cd2+有較好的吸附效果，吸附率高達75.4%。

關(guān)鍵詞：篩選；耐鎘菌株；生物學(xué)特性

中圖分類號： X131.3文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0317-02

收稿日期：2014-04-02

基金項目：廣東省科技計劃（編號：2011B010500018）；廣東省韶關(guān)市科技計劃（編號：313-140513）。

作者簡介：許欽坤（1977—），男，山東單縣人，碩士，講師，主要從事資源微生物利用研究。

通信作者：趙翠燕。E-mail：bethzhao2003@163.com。鎘（Cd）是嚴(yán)重危害人類健康的重金屬元素，極微量就會對人體造成危害，鎘進入人體后，可對腎臟、骨骼、肺部、心血管等器官造成危害。許多農(nóng)村、城市的土壤和水資源受到不同程度的鎘污染，用受污染的水灌溉時，可使灌區(qū)和下游地區(qū)的農(nóng)作物受鎘污染，并富集于農(nóng)作物中，從而進一步危害人體健康。另外，自然環(huán)境一旦被鎘污染，消除其影響是很困難的。生物修復(fù)技術(shù)是重金屬污染土壤治理的重要手段之一，具有處理費用低、對環(huán)境影響小、效率高等優(yōu)點，目前，利用微生物進行重金屬污染土壤的修復(fù)是近幾年國內(nèi)外研究的熱點。微生物是通過代謝活動及其產(chǎn)物來促進重金屬的溶解，從而提高重金屬在土壤中的生物有效性[1]，微生物還能促進植物旺盛生長，增大植物生物量，通過強化植物來修復(fù)重金屬污染土壤。本研究從鎘污染土壤中分離耐鎘細(xì)菌，對其進行初步研究，以期為該細(xì)菌在鎘污染治理中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1土壤樣品采自廣東某鉛鋅礦區(qū)周圍土壤。

1.1.2培養(yǎng)基和試劑牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨6 g、NaCl 3 g、瓊脂粉12.0 g、水600 mL，pH值為7.0～7.2；液體培養(yǎng)基：不加瓊脂的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；篩選培養(yǎng)基：在固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，加人不同濃度的Cd2+溶液。硝酸鎘、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂等試劑，化學(xué)純，均為國產(chǎn)；細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒等，均購于大連寶生物工程有限公司；Goldview，購于廣州瑞真公司。

1.1.3主要儀器手提式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；MAKE KA-1000型低速離心機，海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，金壇市晶玻實驗儀器廠生產(chǎn)；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1菌種的培養(yǎng)及分離純化試驗選用稀釋平板法[2]，在無菌條件下，將一定量的土樣放入一定體積的無菌水中，用移液管反復(fù)吹洗，直至顆粒狀樣品打散，搖勻，分別配制10-2、10-3、10-4、10-5菌懸液；分別吸取0.1 mL菌液，置于含有40 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基內(nèi)，涂布均勻，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待長出菌落后，挑取光滑透明、濕潤的單菌落劃線分離，在37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h，獲得其純培養(yǎng)；進一步轉(zhuǎn)接到含有100 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，選用長勢較好的菌作斜面，4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2菌株常規(guī)生理生化鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[3]，對菌株進行系列生理生化特性試驗，主要包括甲基紅試驗、乙酰甲基醇試驗、淀粉水解試驗、過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗及吲哚試驗等，每組2個平行。

1.2.3耐鎘菌株16S rRNA 基因序列分析將篩選到的菌株接種到培養(yǎng)基平板上，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取單菌落到液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)過夜；用細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒提取總DNA為模板，進行16S rRNA 基因PCR 擴增，所用引物為27 F ：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和R1492：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′[4]。PCR總反應(yīng)體系為：10×buffer 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 1 μL，dNTPs 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，去離子水補至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取 5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，由上海生工公司測序；將16S rDNA的測序結(jié)果輸入基因庫（GenBank）進行序列比對。

1.2.4菌株對鎘的耐受性配制含Cd2+濃度分別為0、100、200、300、400、500、600、700、800 mg/L的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液；將斜面保存的菌株在無鎘液體培養(yǎng)基中活化24 h，以2%接種量接入培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長情況。

1.2.5菌株對鎘的吸收性能將斜面保存的菌株轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；吸取菌液 0.5 mL 接入50 mL滅菌、含Cd2+100 mg/L的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，以不加菌株、直接加入0.5 mL無菌水為對照培養(yǎng)基，于37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h；細(xì)菌懸浮液經(jīng)12 000 r/min離心5 min，取其上清液；用原子吸收儀測定上清液中鎘的濃度，計算菌株對培養(yǎng)液中有效鎘的吸附率：吸附率=（C0-C1）/C0×100%，式中，C0為對照的鎘濃度（mg/L ），C1為吸附后上清液的鎘濃度（mg/L）[5]。試驗重復(fù)3 次。

2結(jié)果與分析endprint

2.1耐鎘菌株的篩選

從含Cd2+100 mg/L的培養(yǎng)基中分離得到1株耐鎘細(xì)菌，菌落乳白色，表面粗糙，不透明，經(jīng)革蘭氏染色呈陰性；菌體桿狀，命名為S-1。經(jīng)生理生化試驗分析，結(jié)果表明，菌株S-1甲基紅、乙酰甲基甲醇、淀粉酶、過氧化氫酶、明膠液化試驗檢測均呈陽性，吲哚試驗檢測呈陰性。

利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，得到長度約為1 500 bp的擴增產(chǎn)物（圖1）。Blast比對分析顯示，菌株S-1與Bacillus cereus AF290547的16S rDNA 序列同源性高達97%，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化試驗結(jié)果，表明 S-1菌株為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

2.2菌株對鎘的耐受性

菌株S-1在含Cd2+濃度范圍0～200 mg/L的液體培養(yǎng)基中生長良好；Cd2+濃度超過300 mg/L時，菌株S-1的生長受到抑制；當(dāng)Cd2+濃度增加到超過700 mg/L時，菌株S-1的生長完全被抑制。這說明菌株S-1對Cd2+的最大耐受濃度為600 mg/L。

2.3菌株對鎘的吸收性能

菌株S-1在含Cd2+100 mg/L的培養(yǎng)基37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h，離心，收集上清液，過原子吸收儀測定上清液中Cd2+的濃度，結(jié)果表明，菌株S-1對Cd2+的吸附率為75.4%。

3結(jié)論

試驗篩選到1株耐鎘菌株S-1，經(jīng)生理生化試驗和16S rRNA序列分析，鑒定該菌株為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）；菌株S-1的Cd2+最大耐受濃度為600 mg/L，對Cd2+的吸附率為75.4%。菌株S-1對鎘具有較強的抗性和富集能力，在鎘污染治理中有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻：

[1]陳素華，孫鐵珩，周啟星，等. 微生物與重金屬間的相互作用及其應(yīng)用研究[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2002，13（2）：239-242.

[2]中國科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類組.一般細(xì)菌常用鑒定方法[M]. 北京：科學(xué)出版社，1978.

[3]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[4]Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[5]王俊麗，任建國. 耐鎘微生物的篩選及其吸附能力研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（3）：499-502.姜曉龍，金磊磊，陳輝輝，等. 1株侵染蓖麻的葡萄座腔菌菌株鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：319-322.endprint