衛(wèi)曉靜　王華忠　岳潔瑜

摘要：小麥白粉病是由小麥白粉菌（Blumeria graminis f. sp. Tritici，Bgt）侵染引起的小麥（Triticum aestivum L.）生產(chǎn)上的主要病害之一，克隆小麥抗白粉病相關(guān)基因并研究其生物學功能具有重要的應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義。以白粉菌Bgt 侵染誘導的攜帶小麥抗白粉病基因Pm21（廣譜抗白粉病基因）“92R137/揚麥1587”為材料，利用SMART（switching mechanism at 5′ end of the RNA transcript）技術(shù)構(gòu)建小麥葉片全長cDNA 文庫。結(jié)果表明，所獲得的原始文庫滴度為1.08×107 CFU/mL，擴展文庫滴度為3.24×107 CFU/mL，重組率98%，插入片段在0.5～2.0 kb 之間，多在1.0 kb左右。該文庫的構(gòu)建為進一步開展小麥抗白粉病相關(guān)基因的克隆及分子生物學研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥白粉??；cDNA文庫；構(gòu)建；質(zhì)量分析

中圖分類號： S435.121.4+6文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0038-03

收稿日期：2014-03-23

基金項目：天津市應(yīng)用基礎(chǔ)計劃青年項目（編號：12JCQNJC09700）；天津師范大學科研基金（編號：52XB1105、52XS1210）。

作者簡介：衛(wèi)曉靜（1989—），女，山西太原人，碩士，研究方向為植物分子生物學。Tel：（022）23766823；E-mail：xiaojing19890404@126.com。

通信作者：岳潔瑜，博士，講師，主要從事逆境植物學研究。Tel：（022）23766823；E-mail：yueshan1982@163.com。小麥白粉菌（Blumeria graminis f.sp. tritici，Bgt）引起的小麥白粉病是世界上小麥主產(chǎn)區(qū)的主要病害之一[1]。白粉菌通過侵染小麥的葉片部位，嚴重時侵染葉鞘、莖稈和穗部，形成覆蓋整個植株的霉層，可導致葉片早枯，光合作用降低，呼吸作用加強，分蘗數(shù)減少，成穗率降低，千粒質(zhì)量下降，可減產(chǎn)5%～10%，重病田減產(chǎn)可達20%以上[2]。白粉菌生理小種較多，常因基因重組和突變而產(chǎn)生具致病力的遺傳變異，導致單一抗病性品種的抗病性易喪失，因此發(fā)現(xiàn)與利用新的抗病基因，選育具有多個抗病基因聚合的持久抗病品種，從根本上制定有效的抗病策略，為研究白粉菌誘導的特異基因的表達提供了新途徑。目前克隆抗病基因常用的方法有轉(zhuǎn)座子標簽法和圖位克隆等方法，并已從擬南芥、煙草、玉米、水稻、小麥、番茄、亞麻等植物中克隆得到 50 多個抗病基因[3-5]。但用轉(zhuǎn)座子標簽法分離抗病基因受到轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)化效率、突變體產(chǎn)生后篩選的難易程度和突變體的表型是否穩(wěn)定遺傳等因素的限制；圖位克隆法前期工作量大、耗時長，準確性高，一般只適合基因組小的物種采用。cDNA 全長文庫在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態(tài)以及表達基因功能鑒定方面具有特殊優(yōu)勢，因此cDNA 全長文庫的構(gòu)建和篩選是基因克隆的重要方法之一，也是目前發(fā)掘新基因和研究基因功能的基本工具[6]。Ma 等構(gòu)建條銹菌誘導的小麥葉片cDNA 文庫，經(jīng)EST 分析發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運子、金屬硫因子、泛素、質(zhì)膜H+-ATPase 和氨基酸透酶等可能參與了寄主與病原菌互作過程[7]。陳玉婷等建立小麥葉銹菌與小麥非親和互作的基因表達數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)多個抗病防御基因及信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因[8]。姜寶杰等采用SMART（switching mechanism at 5′ end of the RNA transcript） 技術(shù)構(gòu)建了花生受低溫、干旱、各種激素、缺鈣及黃曲霉等脅迫誘導的混合全長cDNA 文庫，用于花生抗逆基因的發(fā)掘[9]。本研究運用SMART 技術(shù)構(gòu)建了白粉菌誘導的小麥葉片全長cDNA 文庫，并對文庫質(zhì)量進行初步鑒定，為大規(guī)模表達序列標簽（ expressed sequence tag，EST） 測序，開展基因表達譜分析，克隆和鑒定一批小麥響應(yīng)白粉菌侵染的功能基因奠定了分子基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試小麥材料為攜帶廣譜抗白粉病基因Pm21的“92R137/揚麥1587”。將小麥種子播種于盆缽中，罩以卷成筒狀的透明投影膠片，上覆3層濾紙，防止空氣中白粉菌孢子及其他雜菌落入，然后置于25 ℃人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)（光照16 h/黑暗8 h）。以北方地區(qū)流行的小麥白粉菌15號生理小種E09為供試菌種，白粉菌在密植盆栽的感病品種蘇麥3號上繁殖，接種前24 h抖去老孢子，“92R137/揚麥1587” 苗期對該小種表現(xiàn)免疫（反應(yīng)型為0級）。采用抖落法接種，用蘇麥3號擴繁的E09菌種高密度抖落于第2張葉完全展開的供試材料上。接種后在25 ℃人工培養(yǎng)箱中黑暗保濕，分別在接種后3、6、12、16、24、30、36、48、72 h剪取接種的第2張葉，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2RNA提取

取相同質(zhì)量的白粉菌侵染過的及對照小麥葉片混合放入液氮預(yù)冷的研缽中，充分研磨。采用TRIZOL（Invitrogen）試劑提取總RNA，經(jīng)NandoDrop（ND-1000）Spectrophotometer檢測濃度及純度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.3cDNA 第一鏈和第二鏈合成

按照In-Fusion SMARTTM（Clonetech）試劑盒說明書，以1 μg 總RNA 為模板，以3′ In-Fusion SMARTer CDS Primer（5′-CGGGGTACGATGAGACACCA（T）20VN-3′；N=A、C、G、T，V=A、G、C）作為引物，按照SMART 文庫構(gòu)建試劑盒操作合成cDNA 第一鏈。一鏈cDNA 合成體系總體積為10 μL，其中包括總RNA 1 μg，寡聚核苷酸（SMART Oligonucleotide）1 μL，CDS PCR 引物1 μL，一鏈合成緩沖液（5×First Strand Buffer）2 μL，二硫蘇糖醇（DTT）（100 mmol/L）0.25 μL，dNTP Mix （10 mmol/L）1 μL 和反轉(zhuǎn)錄酶SMARTScribETM Reverse Transcriptase 1 μL，混勻后42 ℃孵育1.5 h，68 ℃加熱10 min終止第一鏈反應(yīng)。

以LD-PCR（long-distance PCR，LD-PCR） 法合成cDNA第二條鏈，向PCR 管中加入2 μL 一鏈模板、10 μL PCR緩沖液（10×Advantage 2 PCR buffer）、2 μL 50×dNTP Mix、2 μL 5′×PCR Primer ⅡA、2 μL In-Fusion SMARTer PCR Primer（5′-CGGGGTACGATGAGACACCA-3′）和2 μL 聚合酶（50×Advantage 2 Polymerase Mix），雙蒸水補足至100 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，66 ℃ 30 s，68 ℃ 6 min，17個循環(huán)。取2 μL雙鏈產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4雙鏈cDNA 純化

按試劑盒說明書要求準備好16 個1.5 mL 離心管及CHROMA SPIN+TE-1000 分級分離柱。將柱內(nèi)基質(zhì)搖勻，消除柱內(nèi)氣泡，移除底蓋使柱內(nèi)緩沖液流盡。加入過柱緩沖液700 μL 使其自然流盡。將混有二甲苯氰的cDNA 加入到柱中，待cDNA滲入基質(zhì)后加入過柱緩沖液100 μL。待自然流盡后加入過柱緩沖液600 μL，將制備好的16 個離心管迅速放在柱下方，每管1 滴，直到緩沖液流盡為止。每管取 3 μL 進行1.1% 瓊脂糖凝膠電泳，150 V 電泳10 min。選擇符合試驗要求的3～4 管，收集到新的離心管中，加入1/10體積醋酸鈉（3 mol/L，pH值4. 8）、糖原（20 mg/mL）1.3 μL、25倍體積的 95% 乙醇 （-20 ℃），-20 ℃過夜，14 000 r/min 離心 20 min，小心移除上清后用去離子水 10 μL 重懸沉淀。

1.5cDNA 與載體的連接轉(zhuǎn)化及菌落PCR 鑒定

取600 ng 的cDNA 與pSMART21FD 質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物經(jīng)QuickClean Resin處理除去連接酶后，電擊法轉(zhuǎn)化到50 μL 大腸桿菌HST08 中，涂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，計算平板上的庫容數(shù)及文庫滴度。從文庫中隨機挑取15 個克隆進行菌落PCR，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA 的提取與質(zhì)量檢測

采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的小麥葉片總RNA質(zhì)量，結(jié)果（圖1）顯示，28S 和18S 2個條帶均完整清晰，亮度強弱對比適宜，總RNA 沒有明顯降解，完整性良好。D260 nm/D280 nm=1.86，D260 nm/D230 nm=2.02，表明RNA 的均一性較好，純度較高，沒有蛋白質(zhì)的污染，滿足建庫要求。

2.2cDNA 合成結(jié)果與分析

采用LD-PCR 法擴增獲得雙鏈cDNA，如圖2顯示，雙鏈cDNA的長度在0.25～5 kb分布，含有中高豐度基因帶，符合植物基因cDNA 的長度范圍。

2.3cDNA片段的回收與純化

雙鏈cDNA 經(jīng)分級后的15 管收集液電泳結(jié)果表明，過柱分離的大于0.4kb的cDNA 片段主要集中于第5～8管中

（圖3），因此收集合并、純化第5～8管的cDNA，用于連接試驗。

2.4cDNA 文庫的質(zhì)量鑒定

原始文庫滴度為1.08×107 CFU/mL，擴增總文庫滴度為3.24×107 CFU/mL，重組率達到98%。從原始文庫中隨機挑選15個單克隆進行PCR鑒定，結(jié)果插入片段分布在0.5 ～2 kb 之間（圖4），以上各指標均表明已獲得較高質(zhì)量的 cDNA 文庫。

3討論

構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫是高效篩選抗白粉病相關(guān)基因的前提，而獲得純度高和完整性好的總RNA是構(gòu)建高質(zhì)量全長cDNA文庫的關(guān)鍵[10-11]。本研究采用改良TRIZOL 法提取

小麥葉片RNA，操作簡便，減少RNase 污染的可能性[12]。在提取RNA 過程中，以幼嫩的小麥葉片為試驗材料，取樣后立即置于液氮中速凍，再于-80 ℃保存，保證了RNA 樣品不被降解。所有器具及藥品均嚴格按照操作步驟和規(guī)范進行，避免RNA 酶的滅活，并在無菌條件下操作。以往常用的cDNA 合成方法中，需要先從總RNA 中純化出mRNA，因此需要大量的試驗材料提取高純度的mRNA[13]，而本研究所采用的SMART 技術(shù)直接利用總RNA 來合成全長cDNA，起始材料用量較少，使用0.05～1.00 μg 的總RNA 就可以利用LD-PCR技術(shù)構(gòu)建雙鏈cDNA，獲得一個大于106 PFU 的全長cDNA 文庫，對于稀有材料而言具有較高的應(yīng)用價值，避免了在分離純化時的多步操作所造成的mRNA的降解[14-15]。通過LD-PCR方法，還避免了當mRNA內(nèi)部存在二級結(jié)構(gòu)或mRNA 長度過長時不能反轉(zhuǎn)錄完全的現(xiàn)象發(fā)生。LD-PCR合成的雙鏈cDNA通過分級分離后，過濾掉了較小的cDNA 片段和酶切反應(yīng)后DNA 片段的殘留物，不僅保證了大片段cDNA 的富集，還減少了后期篩選的工作量。

傳統(tǒng)cDNA 文庫存在克隆片段短等缺點，而全長cDNA 文庫能提供完整的mRNA 信息，且只需通過1 次陽性篩選，即可獲得基因的全長序列，可最大程度地縮短獲取全長基因所花費的時間[16]。文庫的完整性與覆蓋度是構(gòu)建cDNA 文庫的關(guān)鍵性因素，構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA 文庫體現(xiàn)在2個方面：代表性和滴度。cDNA 文庫的代表性可用一個量化的指標——文庫的庫容量來衡量[17]。但是合成雙鏈cDNA的LD-PCR易使高豐度表達基因和短片段cDNA優(yōu)先擴增，大片段（大于3 kb）及低豐度表達基因易于丟失，從而影響文庫的代表性。LD-PCR 的這種偏向性可通過減少循環(huán)數(shù)加以克服，但循環(huán)不足會降低文庫的滴度，使稀有 cDNA 的比例降低，從而降低文庫的質(zhì)量。因此，成功構(gòu)建SMART 文庫的關(guān)鍵因素之一是選出合適的LD-PCR 循環(huán)數(shù)，SMART 試劑盒操作說明書（Clontech 公司）中推薦的循環(huán)數(shù)是 18～20，本研究運用遞增循環(huán)數(shù)的方法將 LD-PCR 的循環(huán)數(shù)確定為 17，既兼顧了文庫的代表性，又兼顧了文庫滴度，盡可能將循環(huán)數(shù)的負面影響降到最低程度。此外，cDNA的量與載體的比例不僅影響連接效率，還關(guān)系到插入片段的大小和文庫的代表性，在相同條件下，與大片段cDNA相比，小片段cDNA 優(yōu)先與載體連接，因此在保證文庫滴度和代表性的前提下，減小cDNA 與載體的連接比例，據(jù)此，設(shè)定了 2 ∶1、2.25 ∶1、 2.5 ∶1 這3種連接比例，其中二者比例為2 ∶1 時獲得最多的陽性克隆。就一般文庫而言，未擴增文庫滴度大于1×106 PFU/mL，重組率高于85% 即為有效文庫[18-19]，本研究所構(gòu)建的原始全長cDNA 文庫為1.08×107 CFU/mL個單克隆，插入cDNA 片段大多數(shù)在500 bp 以上，符合高質(zhì)量文庫的標準，為篩選和研究小麥響應(yīng)白粉菌侵染的關(guān)鍵基因奠定了基礎(chǔ)。

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