曾 源，孫 燦，查保林，伍 欣

(1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，合肥 230000;2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

云南牛干巴是以黃牛后腿肉經(jīng)腌制、晾曬、風(fēng)干發(fā)酵而成的塊狀自然發(fā)酵肉制品，主產(chǎn)于滇東北的尋甸縣、會澤縣、魯?shù)榭h等回民聚居區(qū)，因其悠久的歷史(700 多年)、考究的工藝、獨特的風(fēng)味、酥脆的肉質(zhì)、紫紅的肉色、豐富的營養(yǎng)以及較長的保質(zhì)期等深受各族人民、特別是回民的喜愛，年均上市超過100t［1］。油炸是牛干巴最普遍、最典型的烹飪方法。2002年4月，瑞典國家食品局和斯德哥爾摩大學(xué)的科學(xué)家聯(lián)合公布了他們的研究結(jié)果:在油炸薯條、土豆片等淀粉類食物中，檢測出有致癌可能性的丙烯酰胺［2］。報告一經(jīng)發(fā)表，立即引起了世界各國食品行業(yè)的廣泛關(guān)注，隨后世界上許多國家紛紛對此問題展開了研究和討論，結(jié)果一致認(rèn)為大部分食品經(jīng)過煎、烤、炸等高溫烹調(diào)后會產(chǎn)生含量不等的丙烯酰胺，且其含量隨加工溫度的升高而增加［3］。

國際上普遍采用的丙烯酰胺檢測方法為氣相色譜-質(zhì)譜檢測法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜檢測(LC-MS)，這兩種方法均采用質(zhì)譜檢測器，定性準(zhǔn)確，但是儀器價格昂貴，且GC-MS 法尚需要衍生化處理，操作繁瑣，不適于實驗室推廣［4］。而高效液相色譜法前處理簡單、分離效能高、紫外檢測器定量準(zhǔn)確，采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時間或加外標(biāo)驗證完全可以對丙烯酰胺定性，因此對油炸肉類食品中丙烯酰胺的研究顯得很有必要。本研究簡化了丙烯酰胺的提取過程，建立了一種適合檢測油炸牛干巴中丙烯酰胺含量的快速、準(zhǔn)確、高效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛干巴樣品 購于云南省昆明市沃爾瑪超市(牛干巴成熟1 個月)。

1.1.2 煎炸用油 香滿園大豆油(5L/桶)，購于云南省昆明市沃爾瑪超市。

1.1.3 試劑 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(C3H5NO)，購于上海阿拉丁試劑公司(純度＞99.9%)。甲醇(色譜純)，購于美國Sigma 公司;三氯乙酸、甲醇、石油醚、無水乙醚、無水硫酸鈉、95%乙醉、氫氧化鉀、氫氧化鈉、酚酞、碘化鉀、三氯甲烷、冰乙酸、硫代硫酸鈉、EDTA、淀粉等試劑均為分析純。CarrezⅠ試劑:稱取15g K4［Fe(CN)6］·3H2O 溶于100mL 水中;CarrezⅡ試劑:稱取30g ZnSO4·7H2O 溶于100mL 水中;2-硫代巴比妥酸(純度＞98.5%)，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 Agilent1210 高效液相色譜儀，美國;UNICO 7200 紫外可見分光光度計:美國，中興牌101 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司;TGL-16C 高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;DS-1 高速組織搗碎機(jī)，上海啟前電子科技有限公司;HH-1 恒溫油浴鍋，常州澳華儀器有限公司;SHA-BA 恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司;METTLER TOLEDO-FE20 PH計，瑞士;DENVER INSTRUMENT TD-114 電子分析天平，美國丹佛儀器公司;CHROMA METER CR—400 色差儀，北京科美潤達(dá)儀器設(shè)備有限公司;DRAGON LAB均質(zhì)機(jī)，上海人和科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理方法 分別將含有0%、10%、20%、30%、40%的H2O2溶液60mL 加入到160℃含有1 000mL食用大豆油的恒溫油浴鍋中，再將約20g 的牛干巴片(1×2×1cm)置于其中反應(yīng)3min，取出在室溫下冷卻10min，置于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 煎炸油和牛干巴品質(zhì)分析

(1)煎炸油品質(zhì)分析

過氧化值的測定:參照GB/T5538—2005 動植物油脂過氧化值測定;酸價的測定:參照GB/T5009.37—2003 食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法;羰基價的測定:參照GB/T5009.37—2003 食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。

(2)牛干巴品質(zhì)分析

褐變度的測定:參照翁江來［5］方法進(jìn)行。稱取2g油炸牛干巴樣品，倒入圓底燒瓶，加入20mL 水解液(蒸餾水、氫氧化鈉、亞硫酸鈉質(zhì)量比為200∶10∶1)，放置在55℃水浴鍋中水浴加熱1.5h，使粉末溶解于水解液中;然后取出，加入鹽酸溶液，調(diào)溶液pH4.8，充分振蕩，使溶液中的蛋白質(zhì)沉淀;采用分析濾紙過濾，測量濾液的pH 值及其在420nm 波長處的吸光度，通常用其吸光度的大小代表類黑色素的含量即美拉德反應(yīng)褐變程度。

TBARS 值的測定:參照孫偉［6］方法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取切碎絞勻的油炸牛干巴樣品10g，置于250mL 具塞三角瓶中，加入50mL 三氯乙酸(7.5%)－EDTA (0.1%)混合液，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩60min，然后用雙層濾紙過濾兩次。準(zhǔn)確移取上述濾液5mL 于25mL 比色管內(nèi)，加入5mL TBA (0.02mol/L)溶液，混勻，加塞，置于100℃水浴中保溫40min。取出，冷卻1h，然后移入離心管內(nèi)3 000r/min 離心5min，上清液傾入試管內(nèi)，加入5 mL 氯仿，搖勻，靜置(時間大于1h)，分層，吸出上清液于波長532nm 處比色。

色差的測定:使用CHROMA METER CR—400 色差儀測定。

1.2.3 牛干巴中丙烯酰胺含量的檢測方法

(1)油炸牛干巴樣品的前處理

稱取粉碎后的牛干巴樣品5g，置于30mL 離心管，加5mL 甲醇，均質(zhì)3min，取上清液3mL 離心10min，取上清液加卡瑞試劑1、2 各100μL，離心15min (10 000r/min)，取2.5mL 上清液［7］，(若除油，加7.5mL 正己烷，振蕩2min，移去上層正己烷)，氮吹干，加0.5mL 蒸餾水振蕩2min，然后過C18小柱(過柱前先經(jīng)過1mL 甲醇和1mL 水活化小柱)，收集過濾后的樣液，過自制活性炭固相萃取小柱(活性炭對丙烯酰胺有很強(qiáng)的吸附性)，再用2mL 甲醇洗脫，收集洗脫液過0.45 微孔濾膜，即可進(jìn)樣。

(2)色譜條件的確定

色譜柱為VP—ODS—C18 (150mm (4.6mm);流動相為甲醇:水=10:90;檢測波長為198nm;流速為0.6mL/min;柱溫為25℃;進(jìn)樣量為10μL。

(3)樣品加標(biāo)回收率

稱取5g 油炸牛干巴樣品于30mL 的塑料離心管中，加入5mL 甲醇，然后分別加入1μg/mL 的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mL，經(jīng)高速離心、固相萃取過膜后進(jìn)樣分析。

平行稱取5 份質(zhì)量均為5g 的油炸牛干巴樣品，經(jīng)甲醇提取、高速離心、固相萃取后，通過高效液相色譜儀進(jìn)行分析，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，判斷其精密度。

(4)方法的檢出限

每個樣品平行測定3 次，將丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一系列稀釋，測定丙烯酰胺的色譜峰高，其S/N 為2～3h 的進(jìn)樣量即為該法的最低檢測限。

(5)數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)采用EXCEL2007 和SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煎炸油品質(zhì)變化與油炸牛干巴中丙烯酰胺含量的關(guān)系

煎炸油品質(zhì)變化與油炸牛干巴中丙烯酰胺含量的關(guān)系見表1。

表1 煎炸油品質(zhì)變化與油炸牛干巴中丙烯酰胺含量的關(guān)系

2.2 煎炸油各品質(zhì)參數(shù)與丙烯酰胺含量相關(guān)性分析

油炸牛干巴中丙烯酰胺含量與煎炸油的酸價相關(guān)性最大，與羰基價的相關(guān)性次之，而與過氧化值的相關(guān)性最小，說明了降解程度不同的大豆油對牛干巴丙烯酰胺生成量大小有較大影響。酸價反映的是煎炸大豆油中游離脂肪酸含量的多少，羰基價反映的是在高溫下產(chǎn)生的總羰基類化合物含量的多少［8］。油脂降解產(chǎn)物如羰基類化合物、游離脂肪酸以及極性組分中的某些物質(zhì)(如:醛類化合物)與體系中丙烯酰胺含量的多少應(yīng)該有密切關(guān)系，有可能也為生成丙烯酰胺提供了必要的前提物質(zhì)，所以煎炸油的品質(zhì)與其牛干巴中的丙烯酰胺含量有密切的關(guān)系(表2)。

表2 丙烯酰胺含量與煎炸油各品質(zhì)參數(shù)的相關(guān)性分析

2.3 牛干巴品質(zhì)變化與其中丙烯酰胺含量的關(guān)系

牛干巴品質(zhì)變化與其中丙烯酰胺含量的關(guān)系見表3。

表3 牛干巴品質(zhì)變化與其中丙烯酰胺含量的關(guān)系

2.4 牛干巴各品質(zhì)參數(shù)與丙烯酰胺含量的相關(guān)性分析

油炸牛干巴中丙烯酰胺含量與a*相關(guān)性最大(相關(guān)系數(shù)為0.952)，與褐變度的相關(guān)性次之(相關(guān)系數(shù)為0.941)，而與TBARS 值的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)為0.929)最小(表4)。a*反映了牛干巴的色澤，a*越大，牛干巴越顯紅色。褐變度反映的是牛干巴在美拉德反應(yīng)的最后階段生成的類黑精的含量。TBARS 值反映的是不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生的丙二醛的含量［9］。隨著油脂氧化程度的加劇，類黑精含量不斷增加，而產(chǎn)生丙二醛的氫過氧化物發(fā)生了一定程度的降解，所以牛干巴品質(zhì)與丙烯酰胺含量之間有著密切的關(guān)系。

表4 丙烯酰胺含量與牛干巴各品質(zhì)參數(shù)的相關(guān)性分析

2.5 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取10μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL 定容于100mL 容量瓶中，用高純水分別稀釋成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各進(jìn)樣10μL 進(jìn)行HPLC 測定。以丙烯酰胺濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)建立線性回歸方程(圖1)。

圖1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 顯示，丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品在質(zhì)量濃度在0.01～0.2μg/mL 時，峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=4.228x+0.033，其相關(guān)系數(shù)R2=0.998。

2.6 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC 色譜圖

圖2 顯示，1μg/mL 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品的出峰時間為5.215min。

圖2 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC 色譜圖

2.7 160℃油炸3min 牛干巴樣品中丙烯酰胺的高效液相色譜圖

圖3 顯示，樣品中丙烯酰胺的色譜峰與雜質(zhì)峰完全分離，基本不受干擾，說明樣品前處理條件以及色譜測定條件具有良好的可行性。

2.8 樣品中丙烯酰胺的加標(biāo)回收率和精密度

樣品中丙烯酰胺的加樣回收率為96.61% ±2.48%，表明HPLC 檢測油炸牛干巴中丙烯酰胺具有良好的準(zhǔn)確性。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為1.556%，說明儀器精密度良好(表5)。

表5 樣品中丙烯酰胺的加標(biāo)回收率和精密度

2.9 檢測限

以3 倍信噪比計算最低檢出限，得到丙烯酰胺的最低檢出限為14.7μg/kg。

3 結(jié)論

云南牛干巴中丙烯酰胺含量與煎炸大豆油的酸價相關(guān)性最大(相關(guān)系數(shù)為0.971)，與羰基價的相關(guān)性次之(相關(guān)系數(shù)為0.949)，與過氧化值的相關(guān)性最小(相關(guān)系數(shù)為0.928)。牛干巴中丙烯酰胺含量與牛干巴的a*相關(guān)性最大(相關(guān)系數(shù)為0.952)，與褐變度的相關(guān)性次之(相關(guān)系數(shù)為0.941)，而與TBARS 值的相關(guān)性最小(相關(guān)系數(shù)為0.929)。

前處理過程中，C18小柱結(jié)合活性炭小柱處理油炸牛干巴樣品，能很好地保留丙烯酰胺，除去大部分共存物質(zhì)，該方法的RSD 為1.556%、平均回收率為96.61%、檢出限為14.7μg/kg。本研究建立的方法操作相對簡單快速、精密度較高、回收率較好，具有一定的實用性。

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