韓 雍，汪 慧，宋 曦，李 響

(1 隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅慶陽 745000;2南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210023)

以金納米顆粒、量子點(diǎn)、核殼型熒光納米顆粒為代表的納米粒子在生物芯片、免疫檢測(cè)分析、基因突變檢測(cè)、遺傳病和腫瘤診斷、藥物研究、食品及環(huán)境中強(qiáng)致病性病原菌的檢測(cè)是食品安全檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的重要方向［1-3］。食品的中的殘留真菌毒素引發(fā)的食物中毒是食品安全最為重要的隱患之一，其中以黃曲霉毒素B1(AFB1)最為嚴(yán)重，AFB1濃度較低的糧食和食品無法進(jìn)行控制，傳統(tǒng)的薄層層析TLC 和液相色譜法LC，由于其檢測(cè)周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)要求;微生物法前處理較為繁瑣，耗時(shí)較長;免疫學(xué)方法所用的抗體具有不穩(wěn)定的特性;PCR 計(jì)數(shù)法對(duì)設(shè)備和技術(shù)要求高等。實(shí)現(xiàn)快速、高靈敏、低成本、實(shí)用性強(qiáng)的AFB1檢測(cè)技術(shù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試材料 大米，市售。

1.1.2 儀器與試劑 儀器:JEM2100 透射電鏡(TEM)、RF5301 熒光分光光度計(jì)、Biorad 電泳儀、WH-3 微型漩渦混合儀、HYG-Ⅱa 回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜、TGL-16C 離心機(jī)、DF-101S 型集熱式磁力加速攪拌器、PYX-DH5-50 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱等。試劑:AFB1、羧基甲氧基拉明半鹽酸(CMO)、1-乙基-3-［3-二甲基氨基丙基］碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、牛血清白蛋白(BSA)、甲醇、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、3-乙?；拎ぁ⒘姿猁}緩沖液，以上試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 碲化鎘量子點(diǎn)的制備與表征 參照文獻(xiàn)［4］的方法加以改進(jìn)，具體步驟為:①碲氫化鈉的合成:在50mL 圓底燒瓶內(nèi)首先加入0.031 9g 碲粉(0.025mmol)、緊接著加入5mL 超純水、然后加入0.038 0g 硼氫化鈉(1.2mmol)，充氮?dú)獗Ｗo(hù)，在室溫條件進(jìn)行攪拌反應(yīng)，溶液變成淡紫色結(jié)束反應(yīng)。②巰基丙酸-碲配合物的形成:在250mL 三口圓底燒瓶中首先加入200mL 超純水、然后添加0.114 2g 水合氯化鎘(0.5mmol)和0.109 2g巰基丙酸 (1.2mmol)，并用NaOH 容易調(diào)節(jié)pH 至11.2，充氮?dú)饩S持約30min。③碲化鎘納米晶的制備:將步驟②制備所得溶液添加在巰基丙酸-鎘溶液中，充氮保護(hù)，在120℃進(jìn)行回流反應(yīng)約7h，將反應(yīng)物進(jìn)行透射電鏡掃描和熒光分光光度計(jì)對(duì)其形狀進(jìn)行表征。

1.2.2 量子點(diǎn)與IgG 的結(jié)合與表征 試驗(yàn)通過試劑EDC 和NHS 將羊抗兔IgG 連接到碲化鎘量子點(diǎn)表面［5］，參照文獻(xiàn)［6］方法，優(yōu)化進(jìn)行，具體操作為:①取400μL 的CdTe 量子點(diǎn)溶液，與40μL 含有2mgEDC 的PBS (0.01mol/L，pH 7.4)，在室溫下混合5min，再在搖床中反應(yīng)15～20min。②接著加入0.5mgNHS 混合15min。③最后加入800μL 的IgG (400μL 2mg/mL IgG和400μL PBS 的混合液)，在搖床中混合2h。在4℃下，5 000r/min，離心15min，以除去未反應(yīng)的IgG，吸出上清液，用PBS 清洗1 次后，再離心，沉淀加2mL 超純水溶解，將最終產(chǎn)品保存在4℃。

采用SDS-聚丙烯胺凝膠電泳［7］對(duì)CdTe 量子點(diǎn)與羊抗兔IgG 的結(jié)合物進(jìn)行表征。電泳凝膠采用12%聚丙烯酰胺分離凝膠，首先在80V/cm 的速度條件下進(jìn)行15min，然后在120V/cm 條件下持續(xù)進(jìn)行，直至電泳操作結(jié)束。由于考馬斯亮藍(lán)染色會(huì)干擾量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，因此用凝膠成像儀紫外燈下觀察電泳情況，電泳結(jié)束后進(jìn)行染色處理，在自然光下觀察電泳結(jié)果。

1.2.3 AFB1的檢測(cè) 將制備的AFB1人工抗原包被在微孔板上，洗滌拍干后用BSA 溶液封閉。將標(biāo)準(zhǔn)AFB1溶液梯度稀釋，稀釋倍數(shù)10－6～10－9，按濃度梯度加入離心管中，再加入適當(dāng)濃度的黃曲霉毒素單克隆抗體，37℃孵育。將離心管中混合液加入包被有AFB1完全抗原的平板上，在37℃恒溫箱內(nèi)孵育用PBS (0.01mol/L，pH7.4)洗滌，加入標(biāo)記有CdTe 量子點(diǎn)的羊抗兔-IgG(二抗)孵育，洗滌拍干后加200μL/孔的超純水，置于熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀上檢測(cè)，得到熒光強(qiáng)度曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 碲化鎘量子點(diǎn)納米材料的制備和表征

本試驗(yàn)以鎘鹽、碲粉為基礎(chǔ)材料，以巰基丙酸為量子點(diǎn)包裹劑，利用水溶性長鏈巰基類化合物包裹的合成方法制備碲化鎘量子點(diǎn)，并在水相中按照不同反應(yīng)時(shí)間，制備了不同發(fā)射波長的碲化鎘量子點(diǎn)。通過TEM觀察碲化鎘量子點(diǎn)的粒徑和形狀，利用熒光分光光度計(jì)對(duì)碲化鎘量子點(diǎn)水溶液進(jìn)行光譜性質(zhì)分析。分析結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所合成巰基類化合物包覆的碲化鎘量子點(diǎn)具有水溶性好、穩(wěn)定性好、熒光量子產(chǎn)率高、易于生物標(biāo)記等特點(diǎn)。由圖1 可知，試驗(yàn)合成的量子點(diǎn)的粒徑約為5nm，呈球形分散，在水溶液中能夠較好的分散。由圖2 可知，在280nm 波長的激發(fā)光作用下，碲化鎘量子點(diǎn)的最大發(fā)射波長為560nm，其檢測(cè)光譜可讀性得到顯著提高。

圖1 碲化鎘量子點(diǎn)的透射電鏡圖

2.2 碲化鎘量子點(diǎn)與羊抗兔-IgG 的結(jié)合和表征

圖2 碲化鎘量子點(diǎn)的熒光光譜

試驗(yàn)采用無毒、生物相容性良好的EDC 和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)作為羊抗兔-IgG 的交聯(lián)劑［4］，嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，實(shí)現(xiàn)碲化鎘量子點(diǎn)與IgG 交聯(lián)，利用凝膠電泳判斷碲化鎘量子點(diǎn)表面是否成功標(biāo)記IgG，通過SDS-PAGE 方法對(duì)CdTe 量子點(diǎn)與IgG 的結(jié)合情況進(jìn)行表征。將CdTe 量子點(diǎn)、羊抗兔IgG、CdTe 量子點(diǎn)與IgG 結(jié)合物和蛋白質(zhì)Marker 依次編號(hào)為1、2、3 和4。按照試驗(yàn)方法1.2.2 操作，獲得紫外光和自然光下電泳觀察圖，以此判斷量子點(diǎn)與免疫球蛋白結(jié)合情況。圖3中，左圖在紫外線下觀察，可見1 道和3 道的亮帶，表明電泳物質(zhì)中存在CdTe 量子點(diǎn)。右圖在自然光下觀察，可見2 道和3 道處于相近位置，表明電泳物質(zhì)中含有羊抗兔IgG。由此可見，試驗(yàn)所得碲化鎘量子點(diǎn)與羊抗兔-IgG 成功結(jié)合，并能夠在電泳條件下順利分離。

圖3 QDs-IgG 的12%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.3 AFB1的檢測(cè)

在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，熒光強(qiáng)度與AFB1濃度在稀釋10－6～10－9的倍數(shù)范圍內(nèi)，即1～1 000ng/mL 下呈良好的線性關(guān)系，得到的檢出限為0.3 ng/mL (圖4)。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)AFB1與熒光強(qiáng)度的關(guān)系曲線

取市場(chǎng)上銷售的大米，搗碎，加入不同稀釋倍數(shù)的AFB1，稀釋倍數(shù)為10－6～10－9，用本試驗(yàn)方法測(cè)定熒光強(qiáng)度，并計(jì)算回收率，回收率89.0%～101.07% (附表)，說明本試驗(yàn)所建立的新型檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性較高，可以用于實(shí)際樣品中AFB1的檢測(cè)。

附表 大米樣品中AFB1的檢測(cè)回收率

3 結(jié)論與討論

利用碲粉、水合氯化鉻和巰基丙酸在水相中成功合成了新型發(fā)光量子點(diǎn)碲化鎘量子點(diǎn)，通過TEM、熒光分光光度計(jì)的表征，表明所制備球形納米顆粒具有良好的分散性和均一性，熒光發(fā)射特征與量子點(diǎn)基本保持一致，光穩(wěn)定性得到大幅度提高。將所制備的碲化鎘量子點(diǎn)納米顆粒通過EDC 和NHS 和羊抗兔-IgG 結(jié)合，然后通過電泳分析和TEM 表征，表明成功地將碲化鎘量子點(diǎn)與羊抗兔IgG 結(jié)合。通過對(duì)新制備的量子點(diǎn)與IgG 結(jié)合物進(jìn)行分析性能研究，本試驗(yàn)建立了適用于檢測(cè)AFB1的高靈敏分析方法，檢測(cè)限可達(dá)1 ng/mL。

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