劉效栓，畢映燕，李季文，吳曉琴，錢夢茹（甘肅省中醫(yī)院藥學部，蘭州 730050）

亞麻木酚素是一種與人體雌激素十分相似的植物雌激素?，F(xiàn)代藥理研究證實，亞麻木酚素具有抗氧化、延緩衰老[1]、抗腫瘤[2]、預(yù)防骨質(zhì)疏松[3]、降低血清膽固醇[4]、免疫調(diào)節(jié)等功效，尤其在減輕婦女絕經(jīng)期癥狀、預(yù)防乳癌和前列腺癌等方面具有良好的療效[5]，且其在預(yù)防糖尿病方面也發(fā)揮著重要作用[6]。目前，國內(nèi)外對亞麻木酚素的研究多集中在提取、分離、純化、藥理等方面[7]，關(guān)于亞麻木酚素類藥物制劑的研究則未見文獻報道。本研究以亞麻木酚素緩釋片為研究對象，采用高效液相色譜（HPLC）法測定其中亞麻木酚素的含量，并對其體外釋放度進行研究，以為建立亞麻木酚素緩釋片的質(zhì)量標準、有效控制制劑質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1525型HPLC儀，包括1525型泵、717型進樣器、2487型雙通道紫外檢測器（美國Waters公司）；HS 3120型超聲波清洗儀（寧波新基生物科技股份有限公司）；BS2245型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；RZQ-8D型自動溶出取樣收集系統(tǒng)（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

亞麻木酚素緩釋片（甘肅省中醫(yī)院藥學部自制，批號：20130306、20130309、20130312）；亞麻木酚素對照品（上海同田生物技術(shù)有限公司，批號：MUST-12030303，純度≥98%）；甲醇（天津百世化工有限公司，分析純；天津光復精細化工有限公司，色譜純）；磷酸二氫鉀（上海國藥集團，分析純）；氫氧化鈉（天津市大茂化學試劑廠，分析純）；鹽酸（天津百世化工有限公司，分析純）；蒸餾水（實驗室自制）。

2 含量測定方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Waters Symmetry Shield-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（35∶65，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：282 nm；柱溫：室溫；進樣量：10 μl。在此色譜條件下，樣品中被測成分能夠達到基線分離，相鄰色譜峰的分離度＞1.5，理論板數(shù)以亞麻木酚素峰計應(yīng)大于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取亞麻木酚素對照品9.0 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得。

2.2.2 供試品溶液 取亞麻木酚素緩釋片10片，研細，過4號篩，精密稱取0.2 g，置于100 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲（功率：300 W，頻率：25 kHz）處理15 min，放涼，加甲醇稀釋至刻度，濾過；取續(xù)濾液1 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，振蕩，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按亞麻木酚素緩釋片的處方工藝，精密稱取各輔料適量，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

取“2.2”項下對照品、供試品及陰性樣品溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果表明，樣品中的輔料成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.亞麻木酚素Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative sample；1.secoisolariciresinol diglucoside

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項下的亞麻木酚素對照品溶液適量，加甲醇制成每1 ml含亞麻木酚素0.018、0.045、0.090、0.135、0.180、0.225 mg的系列溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標、亞麻木酚素的質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程：y＝5×106x+21 041（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，亞麻木酚素的質(zhì)量濃度在0.018～0.225 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下的亞麻木酚素對照品溶液10μl，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.94%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液（批號：20130309）10μl，分別于配制0、4、8、12、18、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝1.99%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批亞麻木酚素緩釋片（批號：20130309）粉末各適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，RSD＝1.63%（n＝6），表明該方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量（150.8 mg/g）的亞麻木酚素緩釋片粉末適量，共6份，分別精密加入亞麻木酚素對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

精密稱取亞麻木酚素緩釋片粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 體外釋放度測定方法與結(jié)果

照2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅩC溶出度測定法中的轉(zhuǎn)籃法進行。取亞麻木酚素緩釋片（批號：20130309）6片，分別置于900 ml蒸餾水中，設(shè)定轉(zhuǎn)速100 r/min、溫度（37±0.5）℃，在不同取樣時間點分別取樣5 ml，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過（從取樣至濾過應(yīng)在30 s內(nèi)完成），同時補充5 ml相同溫度、相同體積的水。精密吸取濾液10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，采用外標法計算樣品中的藥物濃度及每片藥物不同時間點的累積釋放度，結(jié)果見表3。

表3 亞麻木酚素緩釋片不同時間點的累積釋放度（n＝6）Tab 3 Results of accumulative releasing ratio at different time points（n＝6）

根據(jù)2010年版《中國藥典》（二部）緩控釋制劑指導原則關(guān)于取樣時間點的規(guī)定（第1點的累積釋放度約30%，第2點約為50%，最后取樣點約為75%），選擇取樣時間點為2、6、12 h進行累積釋放度測定。結(jié)果，本品每片在2、6、12 h時的累積釋放度分別為10%～30%、50%～70%、80%～100%，均符合規(guī)定。

4 討論

4.1 色譜條件的選擇

目前，亞麻木酚素的HPLC法測定多使用梯度洗脫系統(tǒng)[8-9]。筆者曾嘗試了不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-酸、乙腈-酸等流動相梯度、等度洗脫系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇、乙腈等度系統(tǒng)均能將亞麻木酚素與相鄰雜質(zhì)峰完全分離，但由于乙腈揮發(fā)性較甲醇強，毒性較大，故最后選擇甲醇-水等度洗脫作為流動相系統(tǒng)。

4.2 溶出介質(zhì)的選擇

按照釋放度測定法[10]，筆者考察了水、磷酸鹽緩沖液（pH＝6.8）、鹽酸溶液（0.1 mol/L）對亞麻木酚素釋放度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種溶出介質(zhì)對亞麻木酚素的累積釋放度無顯著影響，故選擇水作為溶出介質(zhì)。

4.3 體外釋放度測定方法的選擇

亞麻木酚素緩釋片的凝膠骨架材料易吸水膨脹并產(chǎn)生較大的黏性，易粘于杯底，故采用轉(zhuǎn)籃法進行測定。

4.4 檢測波長和輔料干擾試驗

分別取緩釋片樣品粉末及其輔料各適量，溶于蒸餾水中，分別在190～390 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果顯示，樣品在282 nm波長處有最大吸收，而輔料無吸收，表明輔料對測定無干擾，故最終選擇282 nm作為檢測波長。

綜上所述，該方法準確、簡便，專屬性、重復性好，可用于亞麻木酚素緩釋片的質(zhì)量控制。

[1]房娜.亞麻木酚素抗氧化產(chǎn)品開發(fā)[D].濟南：山東師范大學，2013.

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[3]那曉琳，趙新宇，李麗娜，等.亞麻木酚素對去卵巢大鼠血脂水平的影響[J].營養(yǎng)學報，2012，34（2）：159.

[4]張進麗.亞麻木酚素（SDG）治療中老年女性骨質(zhì)疏松癥的臨床研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2013，23（31）：65.

[5]張文斌，許時嬰.亞麻木酚素的微波輔助提取工藝研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18（2）：286.

[6]沈曉東，李多偉，趙蓉，等.亞麻木酚素的研究進展[J].中成藥，2009，31（4）：598.

[7]張文斌，許時嬰.大孔吸附樹脂法分離純化亞麻木酚素的研究[J].食品工業(yè)科技，2006，27（10）：96.

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[9]龍驚驚.亞麻籽中亞麻油和木酚素SDG的提取工藝研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學，2012.

[10]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄87.