高潔等

摘要：為了在轉(zhuǎn)化當(dāng)代獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系，本試驗(yàn)對(duì)以小麥花藥為受體的轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，金粉粒度0.6μm、金粉濃度100μg/槍、轟擊距離6cm、轟擊壓力1300psi為基因槍轉(zhuǎn)化小麥花藥的最佳參數(shù)組合。用含有5%DMSO的0.2%秋水仙堿溶液處理單倍體植株4h，染色體加倍效率最高，達(dá)到100%；用含1%DMSO的溶液處理12h加倍效率最低，為62.2%。PCR結(jié)果顯示所有T0代陽性植株在T1代都無分離，說明該方法得到的轉(zhuǎn)基因株系在T0代即為純合系。本研究成功建立了以花藥為受體的小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，為小麥遺傳改良提供了一種新的方法。

關(guān)鍵詞：小麥；轉(zhuǎn)基因；受體；花藥；染色體加倍

中圖分類號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）01-0001-06

小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物之一，小麥生產(chǎn)的可持續(xù)性對(duì)于保障糧食安全至關(guān)重要。然而，由于缺少高抗生物或非生物逆境的小麥種質(zhì)資源，在有限的土地資源上進(jìn)一步提高小麥產(chǎn)量異常艱難。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為利用異源基因改良小麥的抗逆性、實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源創(chuàng)新的新突破提供了新的機(jī)遇[1]。

愈傷組織誘導(dǎo)和再生是小麥轉(zhuǎn)基因的關(guān)鍵步驟，迄今為止，已成功用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化的外植體有幼胚[2，3]、幼穗[4]、花藥誘導(dǎo)后的胚狀體[5，6]、小孢子[7]、成熟胚[8]等。這些外植體中，除了花藥誘導(dǎo)后的胚狀體和小孢子為單倍體外，其余皆是二倍體。由于小麥基因組龐大，含有42條染色體，轉(zhuǎn)基因后代純合過程較慢。而以單倍體為受體的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過染色體加倍，可以在轉(zhuǎn)化當(dāng)代獲得純合株系，大大縮短出圃年限。影響染色體加倍效率的因素有很多，植株的發(fā)育狀態(tài)、試劑的種類、處理時(shí)間等都會(huì)對(duì)加倍效率產(chǎn)生影響[9]。秋水仙堿是目前應(yīng)用最為廣泛的加倍劑，但處理不當(dāng)會(huì)對(duì)植株產(chǎn)生致死性的傷害[10]。

到目前為止，未見有以小麥花藥作為轉(zhuǎn)基因受體的報(bào)道。以花藥為受體的小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)首先要獲得轉(zhuǎn)化的單倍體植株，然后經(jīng)過染色體加倍得到可育的轉(zhuǎn)基因后代。為了建立以小麥離體花藥為受體的外源基因?qū)爰夹g(shù)體系，探索高效的染色體加倍技術(shù)，本試驗(yàn)對(duì)影響小麥基因槍轉(zhuǎn)化和單倍體加倍的因素進(jìn)行了詳細(xì)的研究，建立了以花藥為受體的小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。

1材料與方法

1.1質(zhì)粒及試劑

本試驗(yàn)所用的質(zhì)粒為pHAC25，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生物；培養(yǎng)基配制所需的無機(jī)鹽購自國藥集團(tuán)；維生素和抗生素以及激素、GUS染色所需的藥品購自Sigma公司；金粉及基因槍轉(zhuǎn)化過程中所需的耗材均購自伯樂公司。

1.2花藥的分離與預(yù)處理

花藥供體品種為K35，是山東省農(nóng)科院作物所自行選育的具有良好花藥培養(yǎng)能力的高代小麥品系。顯微鏡下觀察花藥發(fā)育情況，選擇單核靠邊期的花藥（圖1A），放入盛有0.3mol/L甘露醇預(yù)處理液的培養(yǎng)皿中，每皿500粒，4℃放置約16h（圖1B）。將浸泡完全的花藥轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（培養(yǎng)皿下放有畫有基因槍轟擊圈的白紙），每皿500粒，用于基因槍轉(zhuǎn)化。

1.3子彈制備與花藥轉(zhuǎn)化

取金粉10mg，70%乙醇沖洗，10000r/min離心1min，重復(fù)3次，加入1ml滅菌水振蕩2min，制成終濃度為10μg/μl的金粉貯藏液。將金粉貯藏液充分渦旋，取100μl放入硅化的1.5ml離心管中，14000r/min離心30s，棄上清；加入50μl滅菌水懸浮金粉，在振蕩器上邊輕微振蕩邊加入1μg/μl的質(zhì)粒10μl，再加入20μl新配制的0.1mol/L的亞精胺和50μl2.5mol/L的CaCl2，高速蝸旋3min，將離心管在冰上放置約2min讓金粉自然沉淀，10000r/min離心10s，棄上清；加入無水乙醇750μl，高速蝸旋，冰上放置約2min讓金粉自然沉淀，10000r/min離心10s，棄上清，用100μl無水乙醇懸浮。

將制備的子彈用基因槍轟擊預(yù)處理后的花藥。

1.4誘導(dǎo)培養(yǎng)與再生苗的篩選及染色體加倍

于無菌操作臺(tái)中將轟擊后的花藥轉(zhuǎn)移到花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（圖1C），32℃暗培養(yǎng)3d后，28℃暗培養(yǎng)約4周，獲得胚狀體（圖1D）。將1～2mm左右的胚狀體轉(zhuǎn)移到含有5mg/Lbiolaphos的再生培養(yǎng)基上，25℃下進(jìn)行再生篩選培養(yǎng)（每天光照16h，光照強(qiáng)度5000lx）。

將高5cm左右的再生苗移栽到裝有栽培基質(zhì)的花盆中，用打孔的廢棄礦泉水瓶罩住小苗，晝夜溫度保持14℃，每天光照14h。有2～3個(gè)分蘗時(shí)，將幼苗從花盆中取出，流水洗凈根部，修剪幼苗，使根長或葉長保留3cm左右。將修剪好的幼苗根部完全浸入含有不同濃度DMSO的0.2%的秋水仙堿加倍液中，18℃恒溫培養(yǎng)。通氣裝置采用普通魚缸通氧機(jī)。將處理完畢的幼苗，流水沖洗根部3h，移栽到裝有栽培基質(zhì)的花盆中，用打孔的廢棄礦泉水瓶罩住小苗，晝夜溫度保持14℃，每天光照14h，待新蘗產(chǎn)生時(shí)，轉(zhuǎn)移到17～25℃的環(huán)境中，直至成熟收獲，即為T0代植株。

1.5轉(zhuǎn)基因植株GUS染色

GUS組織染色液的配制：0.2mol/L磷酸鈉緩沖液1ml；0.1mol/L亞鐵氰化鉀和0.1mol/L鐵氰化鉀各1ml；0.5mol/LNa2-EDTA8ml；200mgX-gluc溶于400μlDMSO中；加水定容至200ml。

GUS組織染色：取待檢測(cè)組織，剪斷或切開后分別放入5ml離心管中，用GUS染色液完全浸沒，37℃振蕩過夜，次日用70%乙醇沖洗2～3次，觀察染色結(jié)果。

1.6轉(zhuǎn)基因植株純合體驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株是否為純合，對(duì)T0代植株和來自同一個(gè)T0代單株的10個(gè)T1代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)對(duì)象為GUS基因。正向引物為5′-GGTCACTCATTACGGCAAAGT-3′，反向引物為5′-GACGACCAAAGCCAGTAAAGT-3′，PCR產(chǎn)物長度為616bp。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，52℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

2結(jié)果與分析

2.1不同金粉濃度和轟擊壓力對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

本試驗(yàn)首先設(shè)計(jì)3個(gè)轟擊壓力和3個(gè)金粉濃度，進(jìn)行9個(gè)試驗(yàn)處理，每個(gè)處理轉(zhuǎn)化花藥2000個(gè)，具體結(jié)果見表1。

從表1可以看出，在花藥數(shù)目相同的情況下，900psi的轟擊壓力下，3個(gè)金粉濃度都沒有得到陽性植株；1100psi的轟擊壓力下，每槍金粉用量為60μg時(shí)得到3個(gè)陽性植株，每槍金粉用量為100μg時(shí)，得到5個(gè)陽性植株，其轉(zhuǎn)化效率分別為0.15%和0.25%；而在1300psi的轟擊壓力下，3個(gè)濃度的金粉都得到陽性植株，其中每槍用量為100μg時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到0.60%。

2.2不同金粉粒度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

依據(jù)上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定了1300psi轟擊壓力和每槍100μg的金粉用量為適宜參數(shù)，在培養(yǎng)條件和轟擊壓力、金粉濃度等轟擊參數(shù)不變的情況下，對(duì)0.6μm和1.0μm兩種不同粒度的金粉進(jìn)行了轉(zhuǎn)化效率試驗(yàn)，每個(gè)處理轉(zhuǎn)化花藥2000個(gè)。結(jié)果顯示，0.6μm的金粉轟擊花藥獲得胚狀體652個(gè)，陽性植株9個(gè)，轉(zhuǎn)化效率為0.45%；而1.0μm金粉轟擊花藥獲得胚狀體703個(gè)，陽性植株5個(gè)，轉(zhuǎn)化效率為0.25%。

2.3不同轟擊距離對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

在上述參數(shù)不變的情況下，設(shè)定6cm和9cm兩個(gè)轟擊距離，每個(gè)處理轟擊花藥2000個(gè)。其中轟擊距離為6cm時(shí)，獲得胚狀體663個(gè)，陽性植株10個(gè)，轉(zhuǎn)化效率為0.50%；而轟擊距離9cm時(shí)，獲得胚狀體861個(gè)，沒有陽性植株。

根據(jù)上述3個(gè)試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)，確定金粉粒度0.6μm、每槍金粉用量100μg、轟擊距離6cm、轟擊壓力1300psi為花藥轉(zhuǎn)化的最佳參數(shù)組合。

2.4通氣方式和不同修剪方式對(duì)加倍效率的影響

如表2所示，當(dāng)單倍體植株根和葉都被修剪至3cm左右時(shí)，通氣情況下，植株存活率和加倍效率都達(dá)到100%；不通氣時(shí)，只有76株存活，存活率為84.4%，存活的植株全部加倍。只修剪根部時(shí)，兩種情況下的加倍效率與根葉皆剪時(shí)沒有明顯差別，分別為99.9%和83.3%。但是，只作修剪葉片而不剪根時(shí)，植株的加倍效率明顯降低，兩種情況下的加倍效率分別為62.2%和57.8%。如果根葉都不剪，通氣時(shí)的加倍效率為45.6%，不通氣時(shí)為44.5%。因此，單倍體的加倍效率受通氣和修剪方式的雙重影響，通氣可以極大提高植株的存活率，修剪可以提高存活植株的加倍率。

2.5不同DMSO濃度和處理時(shí)間對(duì)加倍效率的影響

將具有2～3個(gè)分蘗的單倍體植株的根和葉分別修剪至3cm左右，在含有不同濃度DMSO的0.2%的秋水仙堿溶液中分別加倍處理4、8、12h。如表3所示，DMSO濃度和處理時(shí)間對(duì)植株的存活率有明顯影響，但對(duì)收獲指數(shù)影響不明顯。在含有5%DMSO的秋水仙堿溶液中處理4h或8h，單倍體加倍效率均最高，為100%，其中以4h為最佳處理時(shí)間；用含1%DMSO的溶液處理12h，加倍效率最低，為62.2%。

3結(jié)論與討論

3.1金粉粒度、濃度和轟擊壓力、距離對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

自基因槍轉(zhuǎn)化方法發(fā)明以來，針對(duì)不同作物和組織的轉(zhuǎn)化參數(shù)已經(jīng)建立[11，12]。就小麥而言，對(duì)誘導(dǎo)后愈傷組織的轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)有了非常系統(tǒng)的研究，金粉粒度1μm、每槍30μg、轟擊距離9cm是幼胚轉(zhuǎn)化常用的參數(shù)[13，14]。本試驗(yàn)首次對(duì)基因槍轉(zhuǎn)化花藥的參數(shù)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明金粉粒度0.6μm、每槍100μg、轟擊距離6cm是基因槍轉(zhuǎn)化花藥的最佳參數(shù)。不同組織之間轉(zhuǎn)化參數(shù)的差異，可能與外植體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)?；ㄋ幨且粋€(gè)高度發(fā)達(dá)的器官，外面一層是花藥壁，里面包被著無數(shù)微小的小孢子，轉(zhuǎn)化花藥所產(chǎn)生的單倍體轉(zhuǎn)基因植株實(shí)際上是由小孢子分化產(chǎn)生的。微小的小孢子可能跟粒度微小的金粉顆粒更相配，因此，0.6μm的金粉轉(zhuǎn)化效率更高。而相對(duì)堅(jiān)硬的花藥壁需要比愈傷組織更大的沖擊力，因此，6cm的轟擊距離、1300psi的轟擊壓力轉(zhuǎn)化效率更高。

3.2植株修剪方式、通氣、DMSO濃度和處理時(shí)間對(duì)染色體加倍效率的影響

單倍體誘導(dǎo)和染色體加倍是花藥培養(yǎng)的兩個(gè)關(guān)鍵步驟。在這一過程中，基因型、培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境對(duì)誘導(dǎo)效率和再生能力都有非常大的影響，隨后的單倍體加倍過程又受單倍體生長狀態(tài)、加倍藥劑的種類和處理方式等多種因素的影響[9]。小麥的花藥培養(yǎng)自20世紀(jì)60年代成功以來，已有大量關(guān)于提高愈傷誘導(dǎo)效率和單倍體加倍效率的研究，秋水仙堿是應(yīng)用最為廣泛的加倍劑，通常用法為用0.1%～0.2%的秋水仙堿處理幾個(gè)小時(shí)，但是加倍效率在不同的報(bào)道中差異很大，而且往往伴隨著較高的死苗率[15，16]。DMSO具有穩(wěn)定細(xì)胞骨架、免受外來因素?fù)p傷的作用。本試驗(yàn)中5%DMSO處理提高了植株存活率，進(jìn)一步證實(shí)了DMSO對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。隨著處理時(shí)間的延長，不同濃度DSMO處理的植株存活率均明顯降低，表明秋水仙堿的積累會(huì)嚴(yán)重影響植株存活率。本試驗(yàn)結(jié)果顯示在含有5%DMSO的0.2%秋水仙堿溶液中，處理根葉均經(jīng)過修剪的單倍體植株4h，加倍效果最好。

2結(jié)果與分析

2.1不同金粉濃度和轟擊壓力對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

本試驗(yàn)首先設(shè)計(jì)3個(gè)轟擊壓力和3個(gè)金粉濃度，進(jìn)行9個(gè)試驗(yàn)處理，每個(gè)處理轉(zhuǎn)化花藥2000個(gè)，具體結(jié)果見表1。

從表1可以看出，在花藥數(shù)目相同的情況下，900psi的轟擊壓力下，3個(gè)金粉濃度都沒有得到陽性植株；1100psi的轟擊壓力下，每槍金粉用量為60μg時(shí)得到3個(gè)陽性植株，每槍金粉用量為100μg時(shí)，得到5個(gè)陽性植株，其轉(zhuǎn)化效率分別為0.15%和0.25%；而在1300psi的轟擊壓力下，3個(gè)濃度的金粉都得到陽性植株，其中每槍用量為100μg時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到0.60%。

2.2不同金粉粒度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

依據(jù)上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定了1300psi轟擊壓力和每槍100μg的金粉用量為適宜參數(shù)，在培養(yǎng)條件和轟擊壓力、金粉濃度等轟擊參數(shù)不變的情況下，對(duì)0.6μm和1.0μm兩種不同粒度的金粉進(jìn)行了轉(zhuǎn)化效率試驗(yàn)，每個(gè)處理轉(zhuǎn)化花藥2000個(gè)。結(jié)果顯示，0.6μm的金粉轟擊花藥獲得胚狀體652個(gè)，陽性植株9個(gè)，轉(zhuǎn)化效率為0.45%；而1.0μm金粉轟擊花藥獲得胚狀體703個(gè)，陽性植株5個(gè)，轉(zhuǎn)化效率為0.25%。

2.3不同轟擊距離對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

在上述參數(shù)不變的情況下，設(shè)定6cm和9cm兩個(gè)轟擊距離，每個(gè)處理轟擊花藥2000個(gè)。其中轟擊距離為6cm時(shí)，獲得胚狀體663個(gè)，陽性植株10個(gè)，轉(zhuǎn)化效率為0.50%；而轟擊距離9cm時(shí)，獲得胚狀體861個(gè)，沒有陽性植株。

根據(jù)上述3個(gè)試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)，確定金粉粒度0.6μm、每槍金粉用量100μg、轟擊距離6cm、轟擊壓力1300psi為花藥轉(zhuǎn)化的最佳參數(shù)組合。

2.4通氣方式和不同修剪方式對(duì)加倍效率的影響

如表2所示，當(dāng)單倍體植株根和葉都被修剪至3cm左右時(shí)，通氣情況下，植株存活率和加倍效率都達(dá)到100%；不通氣時(shí)，只有76株存活，存活率為84.4%，存活的植株全部加倍。只修剪根部時(shí)，兩種情況下的加倍效率與根葉皆剪時(shí)沒有明顯差別，分別為99.9%和83.3%。但是，只作修剪葉片而不剪根時(shí)，植株的加倍效率明顯降低，兩種情況下的加倍效率分別為62.2%和57.8%。如果根葉都不剪，通氣時(shí)的加倍效率為45.6%，不通氣時(shí)為44.5%。因此，單倍體的加倍效率受通氣和修剪方式的雙重影響，通氣可以極大提高植株的存活率，修剪可以提高存活植株的加倍率。

2.5不同DMSO濃度和處理時(shí)間對(duì)加倍效率的影響

將具有2～3個(gè)分蘗的單倍體植株的根和葉分別修剪至3cm左右，在含有不同濃度DMSO的0.2%的秋水仙堿溶液中分別加倍處理4、8、12h。如表3所示，DMSO濃度和處理時(shí)間對(duì)植株的存活率有明顯影響，但對(duì)收獲指數(shù)影響不明顯。在含有5%DMSO的秋水仙堿溶液中處理4h或8h，單倍體加倍效率均最高，為100%，其中以4h為最佳處理時(shí)間；用含1%DMSO的溶液處理12h，加倍效率最低，為62.2%。

3結(jié)論與討論

3.1金粉粒度、濃度和轟擊壓力、距離對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

自基因槍轉(zhuǎn)化方法發(fā)明以來，針對(duì)不同作物和組織的轉(zhuǎn)化參數(shù)已經(jīng)建立[11，12]。就小麥而言，對(duì)誘導(dǎo)后愈傷組織的轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)有了非常系統(tǒng)的研究，金粉粒度1μm、每槍30μg、轟擊距離9cm是幼胚轉(zhuǎn)化常用的參數(shù)[13，14]。本試驗(yàn)首次對(duì)基因槍轉(zhuǎn)化花藥的參數(shù)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明金粉粒度0.6μm、每槍100μg、轟擊距離6cm是基因槍轉(zhuǎn)化花藥的最佳參數(shù)。不同組織之間轉(zhuǎn)化參數(shù)的差異，可能與外植體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)?；ㄋ幨且粋€(gè)高度發(fā)達(dá)的器官，外面一層是花藥壁，里面包被著無數(shù)微小的小孢子，轉(zhuǎn)化花藥所產(chǎn)生的單倍體轉(zhuǎn)基因植株實(shí)際上是由小孢子分化產(chǎn)生的。微小的小孢子可能跟粒度微小的金粉顆粒更相配，因此，0.6μm的金粉轉(zhuǎn)化效率更高。而相對(duì)堅(jiān)硬的花藥壁需要比愈傷組織更大的沖擊力，因此，6cm的轟擊距離、1300psi的轟擊壓力轉(zhuǎn)化效率更高。

3.2植株修剪方式、通氣、DMSO濃度和處理時(shí)間對(duì)染色體加倍效率的影響

單倍體誘導(dǎo)和染色體加倍是花藥培養(yǎng)的兩個(gè)關(guān)鍵步驟。在這一過程中，基因型、培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境對(duì)誘導(dǎo)效率和再生能力都有非常大的影響，隨后的單倍體加倍過程又受單倍體生長狀態(tài)、加倍藥劑的種類和處理方式等多種因素的影響[9]。小麥的花藥培養(yǎng)自20世紀(jì)60年代成功以來，已有大量關(guān)于提高愈傷誘導(dǎo)效率和單倍體加倍效率的研究，秋水仙堿是應(yīng)用最為廣泛的加倍劑，通常用法為用0.1%～0.2%的秋水仙堿處理幾個(gè)小時(shí)，但是加倍效率在不同的報(bào)道中差異很大，而且往往伴隨著較高的死苗率[15，16]。DMSO具有穩(wěn)定細(xì)胞骨架、免受外來因素?fù)p傷的作用。本試驗(yàn)中5%DMSO處理提高了植株存活率，進(jìn)一步證實(shí)了DMSO對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。隨著處理時(shí)間的延長，不同濃度DSMO處理的植株存活率均明顯降低，表明秋水仙堿的積累會(huì)嚴(yán)重影響植株存活率。本試驗(yàn)結(jié)果顯示在含有5%DMSO的0.2%秋水仙堿溶液中，處理根葉均經(jīng)過修剪的單倍體植株4h，加倍效果最好。

2結(jié)果與分析

2.1不同金粉濃度和轟擊壓力對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

本試驗(yàn)首先設(shè)計(jì)3個(gè)轟擊壓力和3個(gè)金粉濃度，進(jìn)行9個(gè)試驗(yàn)處理，每個(gè)處理轉(zhuǎn)化花藥2000個(gè)，具體結(jié)果見表1。

從表1可以看出，在花藥數(shù)目相同的情況下，900psi的轟擊壓力下，3個(gè)金粉濃度都沒有得到陽性植株；1100psi的轟擊壓力下，每槍金粉用量為60μg時(shí)得到3個(gè)陽性植株，每槍金粉用量為100μg時(shí)，得到5個(gè)陽性植株，其轉(zhuǎn)化效率分別為0.15%和0.25%；而在1300psi的轟擊壓力下，3個(gè)濃度的金粉都得到陽性植株，其中每槍用量為100μg時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到0.60%。

2.2不同金粉粒度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

依據(jù)上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定了1300psi轟擊壓力和每槍100μg的金粉用量為適宜參數(shù)，在培養(yǎng)條件和轟擊壓力、金粉濃度等轟擊參數(shù)不變的情況下，對(duì)0.6μm和1.0μm兩種不同粒度的金粉進(jìn)行了轉(zhuǎn)化效率試驗(yàn)，每個(gè)處理轉(zhuǎn)化花藥2000個(gè)。結(jié)果顯示，0.6μm的金粉轟擊花藥獲得胚狀體652個(gè)，陽性植株9個(gè)，轉(zhuǎn)化效率為0.45%；而1.0μm金粉轟擊花藥獲得胚狀體703個(gè)，陽性植株5個(gè)，轉(zhuǎn)化效率為0.25%。

2.3不同轟擊距離對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

在上述參數(shù)不變的情況下，設(shè)定6cm和9cm兩個(gè)轟擊距離，每個(gè)處理轟擊花藥2000個(gè)。其中轟擊距離為6cm時(shí)，獲得胚狀體663個(gè)，陽性植株10個(gè)，轉(zhuǎn)化效率為0.50%；而轟擊距離9cm時(shí)，獲得胚狀體861個(gè)，沒有陽性植株。

根據(jù)上述3個(gè)試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)，確定金粉粒度0.6μm、每槍金粉用量100μg、轟擊距離6cm、轟擊壓力1300psi為花藥轉(zhuǎn)化的最佳參數(shù)組合。

2.4通氣方式和不同修剪方式對(duì)加倍效率的影響

如表2所示，當(dāng)單倍體植株根和葉都被修剪至3cm左右時(shí)，通氣情況下，植株存活率和加倍效率都達(dá)到100%；不通氣時(shí)，只有76株存活，存活率為84.4%，存活的植株全部加倍。只修剪根部時(shí)，兩種情況下的加倍效率與根葉皆剪時(shí)沒有明顯差別，分別為99.9%和83.3%。但是，只作修剪葉片而不剪根時(shí)，植株的加倍效率明顯降低，兩種情況下的加倍效率分別為62.2%和57.8%。如果根葉都不剪，通氣時(shí)的加倍效率為45.6%，不通氣時(shí)為44.5%。因此，單倍體的加倍效率受通氣和修剪方式的雙重影響，通氣可以極大提高植株的存活率，修剪可以提高存活植株的加倍率。

2.5不同DMSO濃度和處理時(shí)間對(duì)加倍效率的影響

將具有2～3個(gè)分蘗的單倍體植株的根和葉分別修剪至3cm左右，在含有不同濃度DMSO的0.2%的秋水仙堿溶液中分別加倍處理4、8、12h。如表3所示，DMSO濃度和處理時(shí)間對(duì)植株的存活率有明顯影響，但對(duì)收獲指數(shù)影響不明顯。在含有5%DMSO的秋水仙堿溶液中處理4h或8h，單倍體加倍效率均最高，為100%，其中以4h為最佳處理時(shí)間；用含1%DMSO的溶液處理12h，加倍效率最低，為62.2%。

3結(jié)論與討論

3.1金粉粒度、濃度和轟擊壓力、距離對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

自基因槍轉(zhuǎn)化方法發(fā)明以來，針對(duì)不同作物和組織的轉(zhuǎn)化參數(shù)已經(jīng)建立[11，12]。就小麥而言，對(duì)誘導(dǎo)后愈傷組織的轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)有了非常系統(tǒng)的研究，金粉粒度1μm、每槍30μg、轟擊距離9cm是幼胚轉(zhuǎn)化常用的參數(shù)[13，14]。本試驗(yàn)首次對(duì)基因槍轉(zhuǎn)化花藥的參數(shù)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明金粉粒度0.6μm、每槍100μg、轟擊距離6cm是基因槍轉(zhuǎn)化花藥的最佳參數(shù)。不同組織之間轉(zhuǎn)化參數(shù)的差異，可能與外植體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)。花藥是一個(gè)高度發(fā)達(dá)的器官，外面一層是花藥壁，里面包被著無數(shù)微小的小孢子，轉(zhuǎn)化花藥所產(chǎn)生的單倍體轉(zhuǎn)基因植株實(shí)際上是由小孢子分化產(chǎn)生的。微小的小孢子可能跟粒度微小的金粉顆粒更相配，因此，0.6μm的金粉轉(zhuǎn)化效率更高。而相對(duì)堅(jiān)硬的花藥壁需要比愈傷組織更大的沖擊力，因此，6cm的轟擊距離、1300psi的轟擊壓力轉(zhuǎn)化效率更高。

3.2植株修剪方式、通氣、DMSO濃度和處理時(shí)間對(duì)染色體加倍效率的影響

單倍體誘導(dǎo)和染色體加倍是花藥培養(yǎng)的兩個(gè)關(guān)鍵步驟。在這一過程中，基因型、培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境對(duì)誘導(dǎo)效率和再生能力都有非常大的影響，隨后的單倍體加倍過程又受單倍體生長狀態(tài)、加倍藥劑的種類和處理方式等多種因素的影響[9]。小麥的花藥培養(yǎng)自20世紀(jì)60年代成功以來，已有大量關(guān)于提高愈傷誘導(dǎo)效率和單倍體加倍效率的研究，秋水仙堿是應(yīng)用最為廣泛的加倍劑，通常用法為用0.1%～0.2%的秋水仙堿處理幾個(gè)小時(shí)，但是加倍效率在不同的報(bào)道中差異很大，而且往往伴隨著較高的死苗率[15，16]。DMSO具有穩(wěn)定細(xì)胞骨架、免受外來因素?fù)p傷的作用。本試驗(yàn)中5%DMSO處理提高了植株存活率，進(jìn)一步證實(shí)了DMSO對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。隨著處理時(shí)間的延長，不同濃度DSMO處理的植株存活率均明顯降低，表明秋水仙堿的積累會(huì)嚴(yán)重影響植株存活率。本試驗(yàn)結(jié)果顯示在含有5%DMSO的0.2%秋水仙堿溶液中，處理根葉均經(jīng)過修剪的單倍體植株4h，加倍效果最好。