馮觀貴，劉　騫，孫碧韶，朱景振，龍　洲，李龍坤　(.第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院泌尿外科，重慶 400037；.第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院泌尿外科，重慶 400038)

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·論著·

HCN通道在人體輸尿管自發(fā)性收縮中的作用

馮觀貴1，劉騫1，孫碧韶2，朱景振2，龍洲1，李龍坤1(1.第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院泌尿外科，重慶 400037；2.第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院泌尿外科，重慶 400038)

[摘要]目的應用ZD7288特異性阻斷超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子非選擇性通道(HCN通道)后觀察人輸尿管離體平滑肌肌條自發(fā)性收縮活動的變化，從功能學上初步探討HCN通道在輸尿管平滑肌自發(fā)性收縮中的作用。方法收集臨床上因腎腫瘤或囊腫等行腎切除手術患者的離體輸尿管標本12例，經確認患者手術前均未接受放療、化療或免疫治療等特殊處理，進行輸尿管離體平滑肌肌條實驗，觀察在ZD7288作用下輸尿管離體平滑肌肌條的收縮幅度和頻率的變化。以人腸道組織為陽性對照，剩余標本用于檢測HCN通道在人輸尿管上的表達情況。結果經RT-PCR、WB法(Western blot)技術及免疫組化法檢測，發(fā)現正常人輸尿管存在HCN通道的表達，且HCN通道主要表達于人輸尿管的黏膜層與平滑肌層；離體肌條實驗中加入ZD7288后，肌條的收縮頻率明顯變慢，收縮幅度變化不明顯，自身前后對比有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。結論HCN通道可能在人輸尿管自發(fā)性收縮中發(fā)揮著重要作用。

[關鍵詞]HCN通道；輸尿管；自發(fā)性收縮

超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子非選擇性通道，即HCN通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels)，是慢波起搏通道，主要表達于哺乳動物的心臟和神經系統(tǒng)，在心臟起搏及神經活動中發(fā)揮著重要的作用[1-4]。近年來在豚鼠的腎內髓質集合系統(tǒng)[5]、人或大鼠的膀胱逼尿肌等多個部位相繼發(fā)現了HCN通道[6-7]，但HCN通道在同樣具有自發(fā)蠕動能力的輸尿管中的作用還鮮有報道。本研究采用ZD7288特異性阻斷HCN通道后觀察人新鮮離體輸尿管平滑肌肌條自發(fā)性收縮活動的變化，希望能從功能學上對HCN通道在輸尿管平滑肌自發(fā)性收縮活動中的作用做出初步判斷，為后續(xù)進一步研究提供參考。

1材料與方法

1.1主要試劑

HCN1-4亞型抗人單克隆抗體(Abcam)，逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(Takara,中國大連)，Trizol、RIPA裂解液、PMSF、SDS PAGE 制膠試劑盒(碧云天，中國上海)。

1.2輸尿管及膀胱組織標本的收集

收集我院泌尿外科臨床上因腎腫瘤或囊腫等行腎切除手術患者的離體輸尿管標本12例，其中男7例，女5例，年齡42～76歲，平均(60.6±8.5)歲。經確認患者手術前均未接受放療、化療或免疫治療等特殊處理。腎或輸尿管積水、腎結核等患者輸尿管標本均已排除。膀胱組織來自我院泌尿外科膀胱癌患者的全切手術標本，經確認為距腫瘤5 cm左右的正常組織。

1.3輸尿管離體平滑肌肌條的制備

術中切除新鮮輸尿管標本置于新配4 ℃ Kreb’s液中備用，立即前往實驗室制作成約20 mm×5 mm×2 mm，即體積約200 mm3的肌條組織。每例輸尿管剩余標本分別取組織進行固定和凍存。術中盡量避免對輸尿管進行不必要的鉗夾與牽拉。

1.4肌條實驗

將輸尿管平滑肌肌條一端垂直且無張力懸浮固定于盛有10 mL 37 ℃ Kreb’s液的單腔器官浴槽中，另一端用絲線固定于裝有一維位移微調器(成都儀器廠)的量程為30 g的JZJ01型肌肉張力換能器(成都儀器廠)上，并通以95%的O2和5%的CO2。肌肉張力換能器連接RM-6240C型多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)，選擇通道模式為張力，靈敏度0.75 g，掃描速度5 s/div。肌條在單腔器官浴槽內平衡30 min后，調節(jié)一維位移微調器，使肌條張力升至3.0 g，待肌條出現自發(fā)性收縮且平穩(wěn)，觀察并記錄肌條張力變化曲線15 min，加入ZD7288 10 μl,使單腔器官浴槽的ZD7288終濃度為1×10-5mol/L，觀察15 min，記錄時間-張力曲線。

1.5采用RT-PCR檢測HCN1-4各亞型的表達

運用Trizol 提取輸尿管組織總RNA，檢測濃度及純度合格后按逆轉錄試劑盒說明書方法逆轉錄為cDNA，膀胱組織按同樣方法處理。溫控條件分別是42 ℃、2 min，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，按照RT-PCR試劑盒(DRR037A)進行PCR的擴增，程序如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，Tm退火30 s，72℃延伸30 s，擴增35個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物2%瓊脂糖凝膠110 V恒壓電泳后曝光。以GAPDH作為內參，擴增35個循環(huán)周期，每個標本3個復孔。HCN通道引物序列見表1。

表1　HCN通道相關基因的引物序列與產物長度

1.6采用WB法檢測HCN1-4各亞型的表達

將輸尿管組織用PBS快速清洗，加入預冷的RIPA蛋白裂解液中，盡量剪碎，轉入勻漿器中冰上研磨。裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取的上清液即為輸尿管組織的總蛋白。置于100 ℃ 5 min變性。RC-DC法檢測蛋白濃度，經5%的濃縮膠和8%的分離膠SDS-PAGE電泳，每孔的上樣量為80 μg總蛋白。濃縮膠70 V電泳30 min，分離膠110 V電泳90 min，5%的BSA封閉1 h，免疫抗體反應(稀釋比例，一抗HCN 1∶1 000，GAPDH 1∶1 000，二抗：1∶5 000)。ECL化學發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)中檢測蛋白的表達情況。

1.7免疫組化法(IHC)明確HCN1-4各亞型

將福爾馬林浸泡的輸尿管組織進行包埋，常規(guī)石蠟切片，脫蠟后清水清洗，組織片置入EDTA pH 8.0的枸櫞酸緩沖液中行高壓修復，切片浸入3% H2O210 min。PBS液充分洗滌后滴加一抗于切片上，37 ℃烤箱孵育90 min，PBS液洗3次，每次5 min，二抗室溫孵育30 min；PBS充分洗滌后擦干，上顯色劑，顯微鏡下觀察，達到信號強度后終止顯色，蘇木精襯染、脫水、透明、封片。

1.8數據測量

取輸尿管平滑肌肌條自發(fā)性收縮最穩(wěn)定的2 min進行檢測，波幅使用RM-6240C型多道生理信號采集處理系統(tǒng)軟件進行測量。

1.9統(tǒng)計學方法

2結果

2.1RT-PCR檢測HCN通道相關基因的表達

在人輸尿管組織中可以檢測到HCN通道的4個亞型，以HCN4表達相對較明顯(圖1)。

M:標準；1：輸尿管HCN1；2：膀胱HCN1；3：輸尿管HCN2;4：膀胱HCN2；5：輸尿管HCN3；6：膀胱HCN3；7：輸尿管HCN4；8：膀胱HCN4

圖1RT-PCR檢測HCN通道相關基因的表達

2.2WB法和免疫組化對HCN通道蛋白水平的檢測

WB法和免疫組化技術均檢測到輸尿管組織中HCN通道及其各亞型的表達，且HCN通道在人體輸尿管的黏膜上皮和平滑肌層表達最為明顯(圖2、圖3)。

1：人輸尿管標本1；2：人輸尿管標本2；3：人輸尿管標本3；4：人膀胱標本(陽性對照)

圖2WB法檢測人輸尿管HCN通道的表達

圖3　免疫組化法檢測HCN通道蛋白的表達

2.3ZD7288對人體輸尿管平滑肌自發(fā)性收縮的作用

對術中收集到的人新鮮輸尿管平滑肌進行離體肌條實驗檢測，取肌條收縮平穩(wěn)后收縮幅度和頻率的平均值進行統(tǒng)計學處理并比較。結果顯示，在Kreb’s液中孵育30 min后，給予3.0 g的前負荷下，肌條可出現穩(wěn)定的自發(fā)性收縮，其收縮幅度為(1.531±0.306)g，頻率為(1.609±0.204)次/分，加入ZD7288后收縮幅度為(1.402±0.256)g，頻率為(0.469±0.034)次/分，經統(tǒng)計學檢驗P<0.01差異顯著(圖4)。

圖4　ZD7288對人輸尿管平滑肌自發(fā)性收縮的作用

3討論

HCN通道是一種能被電壓和環(huán)磷酸腺苷調控的、非選擇性陽離子通道，能夠產生特異性的Ih電流，而Ih電流被認為是起搏細胞的重要標志之一。與大部分細胞不同的是，引發(fā)Ih電流的是細胞的超極化電流而非通常的去極化電流，Ih電流進一步引發(fā)動作電位，導致平滑肌收縮，進而影響器官的功能活動。因此有關HCN通道的研究已經成為許多平滑肌器官動力學功能領域的熱點。目前HCN通道的起搏通道作用在心組織及中樞神經系統(tǒng)中均已得到明確。

在泌尿系統(tǒng)中，膀胱與輸尿管都存在著不依賴于神經支配的自發(fā)性興奮性。在文獻報道和我們團隊的前期研究中，已經證實膀胱源性自發(fā)興奮調控在逼尿肌興奮異常中占有重要地位[8]。膀胱中存在有胃腸道起搏樣細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)，并通過酶消化法，體外得到了原代培養(yǎng)的膀胱ICC樣細胞[9-10]。本團隊前期研究發(fā)現ICC細胞的興奮性對膀胱逼尿肌的收縮功能有顯著影響[11-12]，且膀胱ICC具有起搏細胞的Ih內向特征電流[13]，進一步的研究確認在大鼠的膀胱內有HCN通道4個亞型的表達，HCN1表達量相對較多，通過免疫雙染等技術證實HCN通道可能通過ICC細胞在膀胱的自發(fā)性收縮中發(fā)揮著重要作用[6]。Xue等[7]在人的膀胱內也發(fā)現有HCN通道4個亞型的表達，且HCN4表達量相對較多。ICC細胞及其起搏功能的發(fā)現，確立了ICC細胞作為膀胱源性興奮通路的樞紐地位，而其核心是以HCN通路為主導的起搏和整合通路。作為同樣具有自發(fā)性興奮性的輸尿管，HCN通道在其中是否也發(fā)揮著重要作用呢？目前還未發(fā)現有相關報道。本實驗中使用HCN阻斷劑ZD7288阻斷 HCN通道后觀察人新鮮離體輸尿管肌條收縮活動的變化，正是希望能從功能學上對HCN通道在輸尿管平滑肌自發(fā)性收縮活動中的作用進行初步探討。

ZD7288作為HCN通道的非選擇性阻斷劑，在HCN通道功能的研究報道中，研究者們多采用ZD7288這一藥物阻斷HCN通道后觀察機體的反應。但Wu等[14]研究表明ZD7288不僅能阻斷HCN通道及大劑量阻斷T通道外，還能夠阻斷背根神經節(jié)細胞中廣泛分布的鈉通道，且阻斷效果更為明顯，說明ZD7288并非HCN通道的特異性阻滯劑。在我們的研究中，采用ZD7288阻斷人離體輸尿管中的HCN通道，本身已不受到中樞及外周神經的影響，達到相對特異性的效果。

在本研究中，我們收集臨床上因腎臟腫瘤或囊腫等行腎臟切除手術患者的離體輸尿管標本，率先開展以人正常輸尿管組織為模型，采用RT-PCR、WB法及免疫組化技術分別從基因、蛋白水平上證實了正常人輸尿管中HCN通道各亞型的存在，且主要表達于輸尿管的黏膜層與肌肉層。人新鮮輸尿管離體肌條實驗從功能學上初步判斷HCN通道在輸尿管自發(fā)性收縮中發(fā)揮著重要的作用。由于ZD7288短時間內無法洗脫，因此針對人輸尿管平滑肌肌條，在自發(fā)性收縮平穩(wěn)的基礎上，直接加入ZD7288，觀察到肌條收縮頻率明顯變慢，幅度變化不明顯，通過加藥前后的自身對照，統(tǒng)計學分析有顯著差異，說明ZD7288明顯抑制了人輸尿管的節(jié)律性收縮。

前期已有大量研究[15-19]發(fā)現在輸尿管上有ICCs細胞的表達，主要存在于輸尿管的上皮層及部分基層組織，且在輸尿管平滑肌的自發(fā)性收縮中起著重要作用，很可能是輸尿管的起搏細胞。我們團隊前期研究發(fā)現ICCs細胞在豚鼠腎盂輸尿管各部位的分布有顯著差異，其與上尿路平滑肌局部肌條收縮有密切關系[19]。本研究表明HCN通道在人輸尿管自發(fā)性收縮中發(fā)揮著重要的作用，而HCN通道是否是通過ICCs在輸尿管的自發(fā)性收縮中發(fā)揮作用，還有待進一步研究。

在臨床上，輸尿管的功能正常與否與一系列泌尿系動力相關性疾病、先天性輸尿管疾病密切相關，如先天性巨輸尿管、先天性腎盂輸尿管連接處梗阻、膀胱輸尿管反流及輸尿管功能性梗阻等。本研究是對正常人輸尿管自發(fā)性收縮功能的一個初步探索，旨在為今后進一步的相關深入研究打下良好的基礎，系統(tǒng)而深入地闡明HCN通路在輸尿管自發(fā)興奮收縮中的作用和機制，對多種輸尿管疾病的基礎研究和臨床治療具有重要意義。

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(編輯：周小林)

Role of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation nonselective channel in spontaneous contraction of smooth muscles in human isolated ureters

FENG Guan-gui1,LIU Qian1,SUN Bi-shao2,ZHU Jing-zhen2,LONG Zhou1,LI Long-kun1(1.Department of Urology,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400037；2.Department of Urology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate effects of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation nonselective channel in the human ureter on the spontaneous contraction of smooth muscles. MethodsFour HCN subtypes were detected in human ureteral tissue using reverse transcription polymerase chain reaction,Western blotting and immunohistochemical.ZD7288，the HCN blocker, was used to observe the changes of ureteral muscle contraction amplitude and frequency by applying the ureteral smooth muscle strip test in vitro. ResultsHCN1-4 isoforms were all identified in human ureter using reverse transcription-polymerase chain reaction and Western blotting.Through the immunohistochemical,HCN channel was found mostly in the urothelium layer and muscular layer of human ureteral wall.ZD7288 significantly decreased the bladder excitation. ConclusionAll 4 HCN channel hypotypes exist in the human ureter, and affect the ureteral excitation.

Keywords:HCN channel;ureters;spontaneous contraction

[收稿日期]2014-11-18[修回日期] 2014-12-15

[基金項目]國家自然科學基金重點項目(81230017)

doi:10.11659/jjssx.01E015035

[中圖分類號]R693

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)02-0119-04