袁偉紅，潘 琦△，陳國(guó)昌，陳義鋼

（1.宜興市人民醫(yī)院消化科，江蘇宜興214200；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 200025）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一種具有潛在嚴(yán)重后果的常見(jiàn)疾病，尤其重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）病情復(fù)雜，臨床表現(xiàn)兇險(xiǎn)，可導(dǎo)致胰外多器官的嚴(yán)重?fù)p傷而致功能衰竭，病死率高[1-2]。目前尚無(wú)單一的指標(biāo)能在發(fā)病早期（48h內(nèi)）快速、準(zhǔn)確、方便的預(yù)測(cè)急性胰腺炎的嚴(yán)重程度[3]。Pittard等[4]，Sewpaul等[5]研究發(fā)現(xiàn)全身炎性反應(yīng)和AP患者中E-鈣粘蛋白（E-cadherin，E-cad）的表達(dá)明顯增高，且其表達(dá)增高在疾病早期即被發(fā)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立輕癥胰腺炎（mild pancreatitis acute，MAP）及SAP的大鼠模型，通過(guò)分析各組E-cad表達(dá)情況，揭示E-cad在AP中的早期診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量160～180g，清潔級(jí)，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)。大鼠隨機(jī)均分為3組：對(duì)照組、輕癥急性胰腺炎組（MAP組）、重癥急性胰腺炎組（SAP組）。大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，通過(guò)L-精氨酸腹腔注射造模（MAP組為6%L-精氨酸，劑量1g·kg-1·次-1；SAP組為20%L-精氨酸，劑量2.5g·kg-1·次-1），共2次，間隔1h，對(duì)照組注射等量生理鹽水；造模前后均自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及試劑盒 L-精氨酸、戊巴比妥鈉（國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）；E-cad酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒（美國(guó)GBD公司）；羊抗大鼠E-cad抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；ECL顯像試劑盒（美國(guó)Piers公司）。

1.2.2 標(biāo)本采集與檢測(cè) 大鼠于成功造模24h后經(jīng)2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉（50mg／kg）。留取血清用于血淀粉酶及ELISA檢測(cè)。血清淀粉酶活性采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，血清E-cad表達(dá)按照ELISA說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。留取大鼠的胰腺組織一部分用10%中性甲醛固定24～48h，石蠟包埋行病理切片檢查，另一部分液氮凍存用于提取蛋白。

1.2.3 胰腺組織病理學(xué)評(píng)分 蘇木精-伊紅（HE）染色后，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野，以水腫、感染、出血和壞死評(píng)價(jià)胰腺組織損傷程度。具體參考Rongione等[6]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理評(píng)分，各項(xiàng)最低分為0分，最高分為4分，取各項(xiàng)評(píng)分之和為最終得分。

1.2.4 Western blot檢測(cè)胰腺組織E-cad蛋白水平改變 考馬斯亮藍(lán)染色測(cè)定提取胰腺組織蛋白樣品濃度并調(diào)整各上樣量至30μg，加入2×上樣緩沖液，煮沸5min后取上清液在制備好的10%的十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電脈（SDS-PAGE）上（每份樣品按順序加至2個(gè)孔中）行垂直電泳分離。硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)移印跡。以含5%脫脂奶粉封閉，而后將膜從正中剪開(kāi)，一部分加入羊抗大鼠E-cad抗體（1∶1 000稀釋），再以辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)兔抗羊IgG抗體（1∶2 000稀釋）孵育；另外一部分加入小鼠抗大鼠β-actin（1∶1 000稀釋），再以辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)山羊抗小鼠IgG抗體（1∶4 000稀釋）孵育，以上各步驟間用PBS-T常溫下充分洗膜，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用ANOVA單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胰腺等組織大體形態(tài)及病理學(xué)改變 SAP組大鼠胰腺組織出血壞死，部分見(jiàn)血性腹水，光鏡示胰腺小葉輪廓破壞，間質(zhì)水腫，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)；MAP組可見(jiàn)胰腺腫大，胰腺周?chē)倭恐緣乃?，光鏡下可見(jiàn)部分胰腺組織明顯小葉間水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)出血和腺泡細(xì)胞壞死；對(duì)照組大鼠腹腔無(wú)滲出，胰腺無(wú)水腫，病理切片光鏡下無(wú)明顯改變。病理評(píng)分：MAP組（6.75±2.12）分和SAP組（10.38±0.56）分明顯高于對(duì)照組（1.75±0.16）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且SAP組與 MAP組比較，SAP組高于 MAP組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組胰腺病理評(píng)分、血清淀粉酶和E-cad比較情況（±s，n＝8）

表1 各組胰腺病理評(píng)分、血清淀粉酶和E-cad比較情況（±s，n＝8）

a：P＜0.05，與對(duì)照組比較；b：P＜0.05，與 MAP組比較。

組別 胰腺病理評(píng)分（分） 血清淀粉酶（U／L） E-cad（pg／mL）1.75±0.16 301.75±26.89 626.50±72.12 MAP組 6.75±2.12a 1 003.83±111.52a1 025.50±131.33a SAP組 10.38±0.56ab 1 497.29±319.57ab 1 561.75±144.82對(duì)照組ab

2.2 血清淀粉酶和E-cad表達(dá)水平 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)顯示：血清淀粉酶值MAP組和SAP組明顯高于對(duì)照組，且SAP組與MAP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ELISA檢測(cè)血清E-cad結(jié)果顯示MAP組和SAP組均明顯高于對(duì)照組，且SAP組與 MAP組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.3 Western blot檢測(cè)胰腺組織中E-cad蛋白的表達(dá) 與預(yù)染蛋白Mark相對(duì)比，β-actin和E-cad特異性免疫印跡條帶的相對(duì)分子量分別為43×103和120×103（圖1）。經(jīng)電腦掃膜其灰度示，SAP組E-cad表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組及MAP組。

3 討 論

AP系多種病因?qū)е乱让冈谝认賰?nèi)被激活后消化自身胰腺及其周?chē)M織所引起的化學(xué)性炎性反應(yīng)[7]；臨床癥狀輕重不一，輕者有胰腺水腫，重者胰腺發(fā)生壞死或出血，可出現(xiàn)休克和腹膜炎甚至多器官功能障礙，病情兇險(xiǎn)，病死率高[8]。近年來(lái)AP的發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，雖然積極采取各種治療方法，但病死率仍高達(dá)20%～30%[1]。由于血清淀粉酶高低不一定反映病情輕重，臨床胰腺病理取材困難等原因，AP的早期診斷、早期治療及疾病嚴(yán)重程度的早期判斷仍然是亟待解決的難題。

由于發(fā)病因素較復(fù)雜，目前AP確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。Rinderknecht等[9]提出的白細(xì)胞過(guò)度激活假說(shuō)受到普遍的認(rèn)可，該假說(shuō)認(rèn)為異常激活的胰酶在造成胰腺損傷的同時(shí)，激活了胰腺內(nèi)的炎癥細(xì)胞，使其釋放炎癥介質(zhì)，而這些介質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)激活了機(jī)體其他組織的炎癥細(xì)胞，進(jìn)一步釋放大量的炎癥介質(zhì)而產(chǎn)生一系列連鎖反應(yīng)促成全身炎性反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征[10]。E-cad是一個(gè)相對(duì)分子量為120×103的鈣依賴性細(xì)胞黏附分子，介導(dǎo)上皮細(xì)胞間黏附的跨膜糖蛋白，在細(xì)胞外鈣離子參與下介導(dǎo)同種親和性細(xì)胞間的黏附[11]；E-cad的異常表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞易去分化，細(xì)胞間連接松散，易于脫落，并進(jìn)一步誘導(dǎo)血管炎癥細(xì)胞因子等生成，促進(jìn)趨化因子轉(zhuǎn)移[12-13]。Pittard等[4]研究發(fā)現(xiàn)全身炎性反應(yīng)綜合征患者可溶性E-cad的表達(dá)水平顯著增高，更為重要的是，可溶性E-cad顯著增高在炎性反應(yīng)早期即被發(fā)現(xiàn)。

本研究參照Czakó等[14]的急性胰腺炎造模方法的，腹腔注射L-精氨酸建立AP的大鼠模型，檢測(cè)血清淀粉酶值和胰腺病理，結(jié)果顯示MAP組和SAP組血清淀粉酶值和胰腺病理評(píng)分均較對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)造模成功。E-cad的ELISA檢測(cè)結(jié)果及Western blot檢測(cè)胰腺組織中E-cad蛋白的表達(dá)都顯示SAP組E-cad的含量顯著高于MAP組，且兩者都顯著高于對(duì)照組，提示急性胰腺炎早期（本實(shí)驗(yàn)設(shè)定為24h）E-cad蛋白高表達(dá)，與Sewpaul等[5]有類(lèi)似的結(jié)果，提示E-cad在AP早期具有一定的診斷價(jià)值，可能是判斷AP嚴(yán)重程度的一個(gè)早期客觀指標(biāo)[15]。本研究為了與現(xiàn)階段急性胰腺炎診斷的實(shí)驗(yàn)室“金標(biāo)準(zhǔn)”——血清淀粉酶比較，選取了造模后24h為采樣時(shí)間。其更確切的臨床診斷價(jià)值尚需多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照和臨床大樣本多中心的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

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