丁鳳珍, 湯可琴

(江蘇省常州市中醫(yī)醫(yī)院, 1. 藥劑科; 2. 消化內(nèi)科, 江蘇 常州, 213003)

?

論著

丹參注射液對(duì)大鼠急性胰腺炎的預(yù)防機(jī)制研究

丁鳳珍1, 湯可琴2

(江蘇省常州市中醫(yī)醫(yī)院, 1. 藥劑科; 2. 消化內(nèi)科, 江蘇 常州, 213003)

摘要:目的探討丹參注射液對(duì)大鼠急性胰腺炎(AP)的預(yù)防作用及其對(duì)核因子κB(NF-κB)、淀粉酶(Amy)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平的影響。方法SD大鼠36只， 隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、丹參治療組，各12只。建立AP大鼠模型。丹參治療組造模前30 min尾靜脈注射丹參注射液；模型組造模前30 min尾靜脈注射生理鹽水。造模成功6 h后腹主動(dòng)脈采血2 mL，并取胰腺組織標(biāo)本，檢測(cè)Amy、IL-6、TNF-α等指標(biāo)水平。結(jié)果大鼠血清Amy、IL-6及TNF-α水平，胰腺組織中MDA、NF-κB水平，及組織病理學(xué)評(píng)分比較，丹參治療組高于假手術(shù)組，低于模型組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。大鼠胰腺組織中SOD水平比較，丹參治療組低于假手術(shù)組，高于模型組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) 。結(jié)論丹參注射液對(duì)大鼠AP具有一定的預(yù)防作用，可減輕AP的病理?yè)p害程度，降低Amy、IL-6、TNF-α及NF-κB水平，清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度。

關(guān)鍵詞:丹參注射液; 大鼠; 急性胰腺炎; 淀粉酶; 核因子-κB; 腫瘤壞死因子-α

急性胰腺炎(AP)是臨床常見(jiàn)的急腹癥，起病急，病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展快速，重癥患者死亡率高達(dá)10%～30%[1]。AP的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有眾多因素參與。在發(fā)病早期，各種因素引起胰腺腺泡內(nèi)多種酶原被激活、各種炎癥細(xì)胞因子釋放，機(jī)體免疫應(yīng)答失控等連鎖反應(yīng)，易產(chǎn)生全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS), 嚴(yán)重時(shí)可致多器官功能障礙綜合征(MODS)等[2]。丹參對(duì)AP組織損害具有明確的保護(hù)作用，因此在臨床上常用于輔助治療AP[3]。本研究在AP大鼠造模前給予丹參注射液，探討其對(duì)大鼠胰腺病理?yè)p害的預(yù)防作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1　材料

?；悄懰徕c，購(gòu)自上海銘睿生物科技有限公司，批號(hào)MR80419; 丹參注射液，購(gòu)自江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z32021228，規(guī)格2 mL/支；淀粉酶(Amy)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、IL-6、TNF-α試劑盒，均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；NF-酶B鼠單克隆抗體，購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年清潔級(jí)SD大鼠36只，雌雄不拘，體質(zhì)量290～330 g, 購(gòu)自南京君科生物工程有限公司。隨機(jī)分為3組，設(shè)為假手術(shù)組、模型組、丹參治療組，各12只。

1.3　動(dòng)物模型建立

假手術(shù)組大鼠尾靜脈注射生理鹽水1.5 mL/kg, 30 min后麻醉開腹，進(jìn)腹后僅顯露并輕翻動(dòng)胰腺即關(guān)腹。丹參注射液組大鼠造模前30 min尾靜脈注射丹參注射液1.6 mL/kg; 模型組尾靜脈注射生理鹽水1.5 mL/kg。AP大鼠模型的建立參照文獻(xiàn)方法[4]，具體如下：丹參注射液組及模型組大鼠術(shù)前禁食12 h以上，自由飲水。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊巴比妥鈉1.0 mL/kg腹腔注射麻醉。將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剃毛備皮，消毒，鋪無(wú)菌洞巾。取正中切口開腹，經(jīng)胰膽管逆行緩慢加壓注入5%?；悄懰徕c溶液1.0 mL/kg, 保持壓力5 min后退出，縫合并逐層關(guān)腹。大鼠于造模成功后6 h重新開腹，取腹主動(dòng)脈血2 mL備用。之后處死大鼠，快速取胰腺組織標(biāo)本待測(cè)。

1.4　指標(biāo)檢測(cè)

取2 mL血液樣本置于37 ℃中靜置20 min后, 4 ℃條件下, 3 000 r/min離心15 min, 分離血清，置于-20 ℃冰箱中保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清IL-6、TNF-α水平，采用碘淀粉比色法檢測(cè)血清Amy水平，操作嚴(yán)格參考按照試劑盒說(shuō)明書。分離得到胰腺組織，取部分于-80 ℃冰箱中凍存。檢測(cè)時(shí)用冷生理鹽水制備成10%的組織勻漿，4 ℃條件下，10 000 r/min離心15 min, 取上清液，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD、MDA水平，操作嚴(yán)格參考按照試劑盒說(shuō)明書。另一部分組織10%甲醛液固定，石蠟包埋，蘇木精-伊紅(H-E)染色，組織切片，光鏡下觀察其組織病理改變，并按Schmidt法半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分[5]。此外，取部分石蠟切片，常規(guī)脫蠟，梯度水化，采用鏈霉親合素-過(guò)氧化物酶法檢測(cè)胰腺細(xì)胞NF-κB活性。

1.5　觀察指標(biāo)

觀察大鼠血清Amy、IL-6、TNF-α水平，胰腺組織中SOD、MDA水平和NF-κB活性，并觀察大鼠胰腺組織病理改變及組織病理學(xué)評(píng)分。

2結(jié)果

2.1　各組大鼠胰腺組織病理改變及組織病理學(xué)評(píng)分比較

假手術(shù)組大鼠胰腺組織未見(jiàn)明顯的病理改變，其組織病理學(xué)評(píng)分最低為(0.31±0.28)分；模型組大鼠胰腺組織可見(jiàn)出血壞死，腺泡細(xì)胞水腫，呈孤島樣分布，小葉分隔，其組織病理學(xué)評(píng)分最高為(6.25±0.61)分；丹參治療組大鼠胰腺組織病理改變較模型組減輕，胰腺細(xì)胞輕度變性水腫，間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血、小葉間隔增寬，見(jiàn)少量脂肪壞死，其組織病理學(xué)評(píng)分為(5.12±0.42)分。組織病理學(xué)評(píng)分，兩兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1～3。

圖1 假手術(shù)組胰腺組織正常,可見(jiàn)胰島 HE 200倍

圖2 模型組胰腺組織可見(jiàn)出血壞死,腺泡細(xì)胞水腫,呈孤島樣分布,小葉分隔 HE 200倍

2.2　血清Amy、IL-6、TNF-α水平比較

大鼠血清Amy、IL-6及TNF-α水平比較，丹參治療組高于假手術(shù)組，低于模型組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

圖3 丹參治療組胰腺細(xì)胞輕度變性水腫,間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血、小葉間隔增寬 HE 200倍

表1　3組大鼠血清Amy、IL-6及TNF-α水平比較

與假手術(shù)組比較，**P<0.01, 與模型組比較, ##P<0.01。

2.3　胰腺組織中SOD、MDA水平和NF-κB活性比較

大鼠胰腺組織中MDA及NF-κB水平比較，丹參治療組高于假手術(shù)組，低于模型組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。大鼠胰腺組織中SOD水平比較，丹參治療組低于假手術(shù)組，高于模型組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2　3組大鼠胰腺組織中SOD、MDA水平和NF-κB活性比較±s)

與假手術(shù)組比較，**P<0.01, 與模型組比較，##P<0.01。

3討論

AP病程兇險(xiǎn)，并發(fā)癥多、病死率高，其發(fā)生機(jī)制未完全闡明。目前有關(guān)AP早期的病理機(jī)制主要包括胰腺胰酶的自我消化、腸源性細(xì)菌易位及內(nèi)毒素血癥、胰腺微循環(huán)障礙、氧自由基作用和前列腺素平衡失調(diào)及鈣離子內(nèi)流等[6]。其中炎癥細(xì)胞因子、氧自由基、黏附因子、氧自由基、一氧化氮合成酶等活化在其病程的發(fā)展中起重要作用[7]。

丹參注射液的主要成分為丹參酮。丹參味苦，性微寒，善入血分，療諸般血證。丹參注射液具有活血化瘀、通脈養(yǎng)心的功效，廣泛用于冠心病、急性心肌梗死、AP等疾病的治療[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參具有抑制血小板凝聚、降低血液黏度，達(dá)到改善微循環(huán)和血液流變學(xué)的作用，同時(shí)還具有抑制溶酶體的釋放、調(diào)控炎性因子、抑制中性粒細(xì)胞的趨化作用、抗氧化及鈣通道阻滯作用[9]。

研究顯示，在AP發(fā)病早期，抑制炎癥細(xì)胞因子的過(guò)度釋放對(duì)控制SIRS及MODS的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用[10-13]?；罨腘F-κB能與DNA特定κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)和調(diào)節(jié)眾多參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。IL-6、TNF-α及磷脂酶A、氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物等均受到NF-κB 的刺激和調(diào)控。NF-κB可以通過(guò)“扳機(jī)樣作用”觸發(fā)炎癥遞質(zhì)的“瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)”而使得炎癥反應(yīng)的加重和病情的惡化[11,14-16]。故IL-6、TNF-α、NF-κB是反應(yīng)AP嚴(yán)重程度的有效指標(biāo)。鄭俊全[4]的研究表明，在AP大鼠造模前應(yīng)用丹參注射液，能明顯降低IL-6、TNF-α水平及NF-κB等因子的水平。石星亮等[17]的報(bào)道推測(cè)，丹參可能通過(guò)抑制NF-κB的表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng)的加重，但目前尚未明確其確切的分子作用靶點(diǎn)。血清Amy水平的檢測(cè)用于診斷AP歷史已久，臨床應(yīng)用較廣。本研究結(jié)果顯示大鼠血清Amy、IL-6及TNF-α水平，胰腺組織中NF-κB水平，及組織病理學(xué)評(píng)分比較，丹參治療組高于假手術(shù)組，低于模型組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。進(jìn)一步證實(shí)，丹參注射液在AP大鼠造模前即給予干預(yù)性的治療，能夠顯著降低病理?yè)p害程度，降低Amy、IL-6、TNF-α及NF-κB水平，改善炎癥反應(yīng)進(jìn)程，達(dá)到預(yù)防AP的作用。

氧自由基是AP發(fā)病及其并發(fā)其他器官損傷的重要原因之一。一項(xiàng)利用MCLA為化學(xué)發(fā)光探針及高敏感光子計(jì)數(shù)技術(shù)檢測(cè)AP大鼠的胰腺、肝臟表面的超氧自由基的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠發(fā)生AP后2～3 h內(nèi)即有氧自由基產(chǎn)生，提示氧自由基參與了AP的病理?yè)p害過(guò)程[18]。MDA為氧化應(yīng)激損傷性因子，而SOD為氧化應(yīng)激的保護(hù)性因子，這兩項(xiàng)因子的水平能夠反映機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化程度，間接反映細(xì)胞損傷的程度[19]。研究[20]表明，丹參注射液可以通過(guò)降低AP發(fā)生時(shí)氧自由基的水平，提高機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力，以減輕胰腺的病理?yè)p害程度。本研究結(jié)果顯示，大鼠胰腺組織中MDA水平比較，丹參治療組高于假手術(shù)組，低于模型組，且大鼠胰腺組織中SOD水平比較，丹參治療組低于假手術(shù)組，高于模型組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

綜上所述，丹參注射液對(duì)大鼠AP具有一定的預(yù)防作用，可減輕AP的病理?yè)p害程度，降低Amy、IL-6、TNF-α及NF-κB水平，清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度。

參考文獻(xiàn)

[1]路琴, 付萬(wàn)發(fā). 老年急性胰腺炎160例患者預(yù)后及其危險(xiǎn)因素分析[J]. 中華老年多器官疾病雜志, 2013, 12(1): 60.

[2]Bishehsari F, Sharma A, Stello K, et al. TNF-alpha gene (TNFA) variants increase risk for multi-organ dysfunction syndrome (MODS) in acute pancreatitis[J]. Pancreatology, 2012, 12(2): 113.

[3]Wang G, Wen J, Wilbur R R, et al. The Effect of Somatostatin, Ulinastatin and Salvia miltiorrhiza on Severe Acute Pancreatitis Treatment[J]. Am J Med Sci, 2013, 346(5): 371.

[4]鄭俊全. 丹參注射液預(yù)防大鼠急性胰腺炎及其機(jī)制研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2015, 30 (1): 13.

[5]陸啟瑜. 丹參聯(lián)合Celecoxib治療對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷Cycloxygenase-2的相關(guān)機(jī)制研究[D]. 昆明醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院, 2009.

[6]盧世云, 潘秀珍. 重癥急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制研究現(xiàn)狀[J]. 世界華人消化雜志, 2011, 19(23): 2421.

[7]Malmstr ?m M L, Hansen M B, Andersen A M, et al. Cytokines and organ failure in acute pancreatitis: inflammatory response in acute pancreatitis[J]. Pancreas, 2012, 41(2): 271.

[8]李向賓. 復(fù)方丹參注射液佐治急性胰腺炎 35 例[J]. 中國(guó)藥業(yè), 2011, 20(8): 74.

[9]陳衛(wèi)紅, 王欣, 李瀚, 等. 復(fù)方丹參注射液對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠的作用機(jī)制[J]. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 28(2): 204.

[10]Gunjaca I, Zunic J, Gunjaca M, et al. Circulating Cytokine Levels in Acute Pancreatitis—Model of SIRS/CARS Can Help in the Clinical Assessment of Disease Severity[J]. Inflammation, 2012, 35(2): 758.

[11]馬紅英, 陳曉文, 任雅瑾, 等. 重癥急性胰腺炎大鼠心肌核因子-κB 激活和復(fù)方丹參注射液的干預(yù)作用[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志, 2013 (9): 484.

[12]林啟新. 奧曲肽聯(lián)合烏司他丁治療重癥急性胰腺炎臨床研究[J]. 中國(guó)基層醫(yī)藥, 2011, 18(20): 2847.

[13]孫健. 腹腔鏡下腹腔灌洗引流治療重癥胰腺炎的臨床療效觀察[J]. 中國(guó)基層醫(yī)藥, 2011, 18(18): 2517.

[14]沈吉君. 早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)急性胰腺炎患者免疫功能的影響[J]. 中國(guó)基層醫(yī)藥, 2011, 18(17): 2369.

[15]丁紅英, 郝智慧. 重癥胰腺炎早期內(nèi)鏡治療的護(hù)理[J]. 中國(guó)基層醫(yī)藥, 2011, 18(22): 3151.

[16]高金亭, 齊柯, 繆丁丁, 等. 羥乙基淀粉對(duì)急性胰腺炎患者組織灌注及血清腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6、-8水平的影響[J]. 中國(guó)基層醫(yī)藥, 2011, 18(23): 3198.

[17]石星亮, 陳墾, 王暉. 丹參治療急性胰腺炎的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2009, 28(4): 487.

[18]李雷, 王桂敏, 蔣俊明, 等. 丹參對(duì)重癥急性胰腺炎早期多器官組織脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志, 2005, 13 (1): 1.

[19]Armstrong J A, Cash N, Soares P M G, et al. Oxidative stress in acute pancreatitis: lost in translation?[J]. Free Radical Res, 2013, 47(11): 917.

[20]姚常柏, 張麗紅, 于忠行, 等. 急性胰腺炎不同階段應(yīng)用丹參注射液對(duì)大鼠氧自由基變化的研究[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 14(11): 24.

Study on preventive mechanism of Danshen Injection in AP rats

DING Fengzhen1, TANG Keqin2

(1.DepartmentofPharmacy; 2.DepartmentofGastroenterology,ChangzhouTCMHospital,Changzhou,Jiangsu, 213003)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the preventive effect of Danshen (Radix Salviae Miltiorrhizae) Injection in rats with acute pancreatitis (AP) and its influence on the levels of nuclear factor-κB (NF-κB), amylase (Amy), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA). MethodsA total of 36 rats with AP were randomly divided into sham operation group, model group and Danshen treatment group, 12 cases for each group. AP rat models were established. 30 min before model establishment, Danshen Injection was injected to the caudal vein of the rats in Danshen treatment group, while normal saline to that of model group. 6 h before model establishment, arterial blood 2 mL and samples of pancreatic tissues were collected to detect the levels of Amy, IL-6 and TNF-α, etc. ResultsDanshen treatment group was evidently higher in sham operation group but prominently lower than model group in serum levels of Amy, IL-6 and TNF-α and levels of MDA and NF-κB in pancreatic tissues as well as histopathological scores, and there were significant differences (P<0.01). Additionally, Danshen treatment group was markedly lower than sham operation group but notably higher than model group in SOD level in pancreatic tissues of AP rats, and the difference was significant (P<0.01). ConclusionDanshen Injection has certain preventive effect on AP rats, and it can alleviate the pathological damage severity, reduce the levels of Amy, IL-6 and TNF-α, remove free radicals and relieve the severity of lipid peroxidation.

KEYWORDS:Danshen Injection; rat; acute pancreatitis; amylase; nuclear factor-κB; tumor necrosis factor-α

基金項(xiàng)目:中國(guó)高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項(xiàng)資金(11522339)

收稿日期:2015-01-20

中圖分類號(hào):R 576

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)17-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201517001