?

兔MSCs移植對兔角膜緣干細胞形態(tài)、增殖、分化的影響

余錦強,李凌,李儒華,柯峰,李芳,邵杰

[摘要]目的探討兔骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)移植對兔角膜緣干細胞形態(tài)、增殖、分化的影響。方法無菌條件下取兔骨髓,分離得到兔MSCs。取培養(yǎng)3代后MSCs消化后制成細胞懸液,接種于羊膜植片上,常規(guī)培養(yǎng)。建立兔角膜堿燒傷干細胞缺損模型4 w后,將18只新西蘭兔隨機分為空白組、MSCs移植組和模型組,每組6只。MSCs移植組和模型組分別用尼龍縫線將空白和帶有兔MSCs的羊膜基質(zhì)植片間斷縫合固定于淺層鞏膜上,空白組不做處理。術(shù)前、術(shù)后觀察實驗兔眼表形態(tài),并進行評分。術(shù)后4 w處死動物,免疫組化檢查細胞角蛋白AE5表達情況。結(jié)果篩選得到的兔MSCs細胞均一性達98.12%；術(shù)后MSCs移植組兔眼表形態(tài)綜合評分顯著降低,而模型組無顯著變化,同期與模型組綜合評分相比,均顯著低于模型組(P<0.05)；免疫組化檢測結(jié)果顯示,空白組和MSCs移植組AE5陽性表達率均為100.00%,顯著高于模型組(P<0.05)。結(jié)論以羊膜基質(zhì)為載體移植MSCs治療角膜緣干細胞缺乏癥,可增殖分化為角膜上皮細胞而發(fā)揮功能,療效顯著,可為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]骨髓；間充質(zhì)干細胞；角膜緣；干細胞缺損；增殖；分化

眼部的酸堿化學(xué)燒傷等多種原因,可以導(dǎo)致角膜緣干細胞缺損,從而引起角膜表面持續(xù)性結(jié)膜上皮化,進而出現(xiàn)角膜上皮缺損[1]。目前,對角膜緣干細胞缺損的治療主要包括角膜緣干細胞同種異體移植和自體移植。雖然獲得一定的臨床效果,但是都具有一定的局限性[2-3]。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因具有高增殖性、多項分化潛能諸多優(yōu)點而備受關(guān)注,但是在眼科領(lǐng)域應(yīng)用較少[4-5]。本研究探討了兔MSCs移植對兔角膜緣干細胞形態(tài)、增殖、分化的影響,期望能為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗動物健康新西蘭兔18只購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心(合格證編號：101304253),體重為2.0~2.5 kg,飼養(yǎng)溫度為20~25 ℃,自然光照。

1.2主要試劑和儀器鼠抗兔CD45、鼠抗兔CD29、鼠抗兔CD34和鼠抗兔AE5單克隆抗體(Epigentek公司),FITC和Cy3標(biāo)記熒光二抗(美國Sigma-Aldrich公司),氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、Envision二步法免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),FACSCALIBUR流式細胞儀。

1.3方法

1.3.1兔MSCs的分離培養(yǎng)無菌條件下取兔髂骨骨髓,加入5 ml基本培養(yǎng)基混勻后,離心(1000 r/min×10 min),棄上清,重復(fù)3~5次。DMEM培養(yǎng)基重懸細胞,細胞計數(shù),接種后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2兔MSCs的鑒定分離得到的MSCs培養(yǎng)3代后,消化后制成細胞懸液,調(diào)整細胞密度(1×105/L)接種于24孔板,每隔24 h于其中3孔培養(yǎng)板中加入Trypsin-EDTA液,消化制成細胞懸液后計數(shù),繪制細胞生長曲線。另取培養(yǎng)3代后MSCs消化后制成細胞懸液,PBS洗滌3~5次,加入熒光標(biāo)記的鼠抗兔CD45單克隆抗體,鼠抗兔CD29單克隆抗體,鼠抗兔CD34單克隆抗體,孵育30 min,于流式細胞儀檢測。

1.3.3羊膜的制備與種植MSCs無菌條件下取健康足月剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦的羊膜,按參考文獻[6]方法清洗處理,于顯微鏡下觀察證實無細胞殘存。無菌條件下,平鋪于6孔培養(yǎng)板中備用。取培養(yǎng)3代后MSCs消化后制成的細胞懸液,接種于羊膜植片上,常規(guī)培養(yǎng)[7]。

1.3.4兔角膜堿燒傷干細胞缺損模型的建立及鑒定常規(guī)方法麻醉兔后,無菌干棉球吸角膜表面液體。取預(yù)先浸泡于1 M NaOH的圓形濾紙,瀝干后覆蓋于實驗兔的一只眼球角膜中央,1 min后取下,用生理鹽水清洗無菌干棉球吸角膜表面液體,即為兔角膜堿燒傷干細胞缺損模型。每天觀察記錄結(jié)膜炎癥、眼球粘連、角膜基質(zhì)溶解、穿孔等情況。

1.3.5兔MSCs移植實驗上述模型建立4 w后,將18只新西蘭白兔隨機分為3組：空白組、MSCs移植組和模型組,每組6只。MSCs移植組和模型組兔采用常規(guī)麻醉,切除兔眼角膜及角膜緣表面的壞死組織,暴露基質(zhì)淺層,沿角膜緣環(huán)形剪開球結(jié)膜,暴露角膜緣后4 mm處的鞏膜；分別用10-0尼龍縫線將帶有兔MSCs或空白的羊膜基質(zhì)植片間斷縫合固定于淺層鞏膜上,其邊緣超出角膜緣約2~3 mm。術(shù)后金霉素眼膏涂于眼部,行瞼裂縫合?？瞻捉M不做處理。

1.3.6眼表形態(tài)評分角膜新生血管：無新生血管為0分,新生血管位于角膜緣內(nèi)2 mm為1分,新生血管位于角膜周邊≤1/2象限為2分,新生血管位于角膜周邊>1/2象限為3分,全角膜可見新生血管生長為4分；角膜渾濁度：角膜透明無渾濁為0分,輕度渾濁為1分,中度渾濁為2分,重度渾濁為3分,極度渾濁為4分。

1.3.7免疫組化檢查手術(shù)后4 w處死動物,取角膜組織,2 h內(nèi)完成標(biāo)本取材,標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定、梯度酒精脫水、石蠟包埋,備用。切片脫蠟至水,HE染色后觀察。采用Envision二步法進行AE5表達定位及半定量分析,嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作。每張切片隨機抽取5個高倍鏡下視野,計算陽性細胞百分?jǐn)?shù)。

1.4結(jié)果判定應(yīng)用彩色病理圖像分析系統(tǒng),在高倍鏡下測定免疫組化結(jié)果。切片中出現(xiàn)棕黃或棕黑色物為CD45、CD29及CD34陽性染色,不著色為陰性。按陽性染色面積進行分級,Photoshop軟件圖像分析測量陽性染色區(qū)域占總面積的百分比。所有區(qū)域陽性染色面積<10%為(-),在11%~50%為(+),在51%~80%為(++),>81%為(+++)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法所有資料采用SPSS 13.0進行分析處理,計數(shù)資料采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,行t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1生長曲線兔MSCs體外培養(yǎng)生長曲線見圖1。原代兔骨髓間充質(zhì)干細胞接種3~4 h后開始貼壁,24 h大量貼壁；2~3 d見部分集落形成,大多數(shù)細胞有胞漿突起；5~7 d集落迅速增多,以梭形細胞為主,胞漿豐富、核大,細胞呈平行排列或漩渦狀生長。

圖1　兔MSCs體外培養(yǎng)生長曲線

2.2兔MSCs的鑒定流式細胞儀檢測結(jié)果顯示(表1),培養(yǎng)的兔骨髓來源的細胞是兔MSCs,不含有造血系細胞。

表1　流式細胞儀檢測結(jié)果

2.3效果評價術(shù)前模型組和MSCs移植組眼表形態(tài)綜合評分顯著高于空白組,表明模型建立成功。術(shù)后MSCs移植組兔眼表形態(tài)綜合評分顯著降低,而模型組無顯著變化,同期與模型組相比,均顯著低于模型組。見表2。

表2　不同時間各組眼表形態(tài)綜合評分比較

注：與本組術(shù)前相比,①P<0.05；與同期模型組相比,②P<0.05

2.4免疫組化結(jié)果空白組和MSCs移植組AE5陽性表達率均為100.00%,顯著高于模型組(P<0.05,表3)。

表3　免疫組化檢測AE5表達結(jié)果(只)

注：與模型組相比,①P<0.05

3討論

角膜上皮層位于角膜表面,健康的機體,角膜上皮層可不斷脫落、更新,當(dāng)角膜上皮受到損傷后,自身也能在角膜緣干細胞(limbal stem cells,LSCs)的幫助下快速完成修復(fù)。Schermer最早發(fā)現(xiàn)角膜上皮細胞均表達細胞角蛋白(CK3),證明了角膜緣干細胞的存在,其主要位于角膜緣基底處的“vogt”柵欄區(qū)[8]。

研究表明,MSCs具有多項分化能力,一方面與其多能性有關(guān),另一方面與其所處環(huán)境有關(guān)[9]。前者是MSCs本身內(nèi)在的特性所決定的,如與多能性有關(guān)的基因的開啟；后者主要是與其微環(huán)境中的信號分子有關(guān)。如VEGF促進MSCs向血管內(nèi)皮分化,MSCs與某種細胞接觸或共培養(yǎng)后,MSCs呈現(xiàn)出此細胞的特征。如MSCs向神經(jīng)細胞分化。本研究中篩選得到的兔MSCs細胞均一性達98.12%,表明本實驗培養(yǎng)的細胞為MSCs。

MSCs可在體外誘導(dǎo)分化為上皮細胞,體內(nèi)實驗研究亦證明了這一點。本研究發(fā)現(xiàn),術(shù)前模型組和MSCs移植組眼表形態(tài)綜合評分顯著高于空白組,表明模型建立成功。術(shù)后MSCs移植組兔眼表形態(tài)綜合評分顯著降低,而模型組無顯著變化,同期與模型組相比,均顯著低于模型組,提示MSCs移植組體內(nèi)MSCs分化成角膜干細胞,具有上皮細胞的特征。戢維穎[6]在體外成功誘導(dǎo)兔MSCs分化成角膜上皮細胞,與本研究結(jié)果一致。免疫組化檢測結(jié)果進一步證明了這一點,空白組和MSCs移植組AE5陽性表達率均為100.00%,顯著高于模型組(P<0.05)。AE5為角膜上皮細胞的標(biāo)志蛋白,直接證明了角膜上皮細胞的存在,與盧建民[7]結(jié)論一致。

研究證實,在含角膜纖維細胞的膠原凝膠上培養(yǎng)角膜上皮細胞,其增殖分化良好。而在缺乏角膜纖維細胞時,其增殖分化能力受到影響,出現(xiàn)功能缺陷[6]。角膜基質(zhì)可作為角膜上皮細胞和角膜緣干細胞生長的微環(huán)境,誘導(dǎo)胚胎干細胞和皮膚干細胞定向分化,重建角膜上皮。而MSCs不僅可分化為角膜上皮細胞,而且具有為角膜緣干細胞的生長發(fā)育提供營養(yǎng)支持的作用,甚至維持角膜緣干細胞功能的穩(wěn)態(tài)。

綜上所述,以羊膜基質(zhì)為載體移植MSCs治療角膜緣干細胞缺乏癥,可增殖分化為角膜上皮細胞或角膜上皮細胞樣細胞而發(fā)揮功能,療效顯著,可為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。但由于缺乏臨床試驗,本結(jié)論尚有待于進一步的證實。

【參考文獻】

[1]潘鳳,李志強,楊曉勤.角膜緣干細胞移植與單純球結(jié)膜瓣移植治療翼狀胬肉療效比較[J].實用防盲技術(shù),2014,9(1):13-15.

[2]劉小勇,張曉玲,周清,等.自體角膜緣干細胞移植和羊膜移植治療翼狀胬肉的療效及安全性[J].中國老年學(xué)雜志，2014,34:3517-3520.

[3]Zhong H,Cha XP,Wei T,et al.Prevalence and risk factors for pterygium in rural adult Chinese populations of the Bai Nationality in Dali:the Yunnan Minority Eye Study[J].Invest Opthalmol Vis Sci,2012,53:6617-6621.

[4]齊文娟.骨髓間充質(zhì)干細胞遷移分化為角膜上皮樣細胞的初步研究[D].廣州：暨南大學(xué),2013.

[5]Kassem M.Mesenchymal stem cells:biological characteristics and potential clinical applications[J].Cloning Stem Cells,2004,6(4):369-374.

[6]戢維穎.體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞與羊膜構(gòu)建角膜上皮細胞移植片用于眼表重建[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院眼科全軍眼科研究所,2008.

[7]盧建民.兔骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療角膜緣干細胞缺損的實驗研究[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué),2007.

[8]Sehlotzer-Sehrehardt U,Kruse FE.Identification and characterization of limbal stem cells[J].Exp Eye Res,2005,27:1-18.

[9]張麗娟.翼狀胬肉角膜緣干細胞移植術(shù)后眼表改變的臨床觀察[J].中國臨床研究,2014,27(4)：460-461.

Effect of MSCs transplantation on morphology,proliferation,and differentiation of rabbit corneal limbal stem cell

Yu Jinqiang,Li Ling,Li Ruhua,Ke Feng,Li Fang,Shao JieDepartment of Ophthalmology,Affiliated Shiyan People's Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei,442000,China

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)transplantation on morphology,proliferation,and differentiation of rabbit corneal limbal stem cell.MethodsRabbit bone marrow was obtained under sterile conditions and MSCs were obtained by isolation.Cell suspension was prepared after digestion of MSCs cultured for three generations and inoculated in the amniotic membrane graft,and conventional culture was provided.And then,a rabbit corneal alkali burn stem cell defect model was built.After four weeks,18 New Zealand rabbits were randomly divided into blank group,MSCs transplantation group and model group(n=6 per group).For the MSCs transplantation group and model group,nylon suture was used to fix the amniotic membrane grafts with and without MSCs discontinuously to the superficial sclera,and no treatment was provided for the blank group.The preoperative and postoperative ocular surface morphology of the experimental rabbits were observed and scores were kept.The rabbits were put to death after four weeks since the operation,and immunohistochemistry method was used to examine the expression of cytokeratin AE5.ResultsThe homogeneity of rabbit MSCs obtained by screening reached to 98.12%;The comprehensive scores of postoperative ocular surface morphology of the rabbits in the MSCs transplantation group decreased significantly,while the model group did not change significantly;compared with the model group,the comprehensive scores in the same period were all significantly lower than that in the model group(P<0.05);immunohistochemistry results showed that the positive expression rates of AE5 in the blank group and MSC transplantation group were 100.00%,significantly higher than that in the model group(P<0.05).ConclusionTaking amniotic membrane matrix as a carrier for MSCs transplantation in treatment of corneal limbal stem cell deficiency is available for proliferation and differentiation of corneal epithelial cells,and the curative effect is obvious;this provides theoretical basis for the clinical application.

[Key words]bone marrow;mesenchymal stem cells;corneal limbal stem cell defect;proliferation;differentiation

(收稿日期:2014-10-31)

文章編號1004-0188(2015)02-0134-04

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.02.008

中圖分類號R 779.65

文獻標(biāo)識碼A

通訊作者:邵杰,電話：13733573141；E-mail：swhmv-526@163.com

基金項目:十堰市科學(xué)技術(shù)研究與開發(fā)項目[十科發(fā)(2010)23號2010-014z]
作者單位:442000 湖北 十堰,湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院眼科