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        PCR 檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素基因

        2015-03-06 04:57:14宋衍燕邵希鳳韓曉瑄韓慶華王軍波
        中國食物與營養(yǎng) 2015年2期
        關(guān)鍵詞:腸毒素金黃色葡萄球菌

        顧 琳 ,黃 平,宋衍燕,高 艷,邵希鳳,韓曉瑄,韓慶華,王軍波

        (1北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院,北京 100191;2北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心,北京 100021)

        金黃色葡萄菌隸屬于葡萄球菌屬,是人類重要的致病菌之一。食品中的金黃色葡萄球菌可能引起食物中毒,其致病因素主要為金黃色葡萄球菌腸毒素。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素,目前已發(fā)現(xiàn)18 種腸毒素基因型。腸毒素可耐受100℃煮沸30min 而不被破壞。金黃色葡萄球菌為侵襲性細(xì)菌,產(chǎn)生的腸毒素對腸道破壞性大,所以金黃色葡萄球菌腸炎起病急、中毒癥狀嚴(yán)重,主要表現(xiàn)為嘔吐、發(fā)熱、腹瀉,還會增加慢性病的患病風(fēng)險,1%—5%的急性胃腸炎患者會轉(zhuǎn)變成嚴(yán)重的疾病或慢性病,如風(fēng)濕病、僵硬性脊椎炎、Reiter's 綜合征、營養(yǎng)吸收不良、溶血性尿毒癥、動脈硬化癥和格林巴利綜合癥、肝炎等疾?。?]。2013 年國家衛(wèi)計(jì)委通報(bào)的《2013 年全國食物中毒事件情況》顯示,微生物性食物中毒事件中毒人數(shù)最多,占總中毒人數(shù)的60.4%,其中主要是由金黃色葡萄球菌及其腸毒素引起的食物中毒。因此及時檢測出食品中的金黃色葡萄球菌及其腸毒素,能夠保障食品安全,維護(hù)公眾健康。本研究通過PCR 技術(shù)檢測食品中檢出的金黃色葡萄球菌腸毒素基因的攜帶情況,探討與食物中毒發(fā)生相關(guān)的金黃色葡萄球菌腸毒素基因類型。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        實(shí)驗(yàn)室保存菌株,至2012 年共收集食品中檢出的金黃色葡萄球菌22 株,其中食物中毒中檢出17 株、食品中檢出5 株。

        1.2 方法

        對食品中檢出的金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌菌株分離培養(yǎng),經(jīng)法國生物梅里埃公司的GP 系統(tǒng)鑒定為金黃色葡萄球菌,再應(yīng)用PCR 檢測每例樣本中sea、seb、sec、sed、see、seg、sei、sem、sen、seo、seu、sej、sep、seq、she、sek、sel、ser 等18 種腸毒素基因的攜帶情況。

        1.3 儀器設(shè)備及試劑

        全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)VitekⅡcompact (法國)、天根細(xì)菌DNA 提取試劑盒、伯樂PCR 擴(kuò)增儀S1000 (美國)、毛細(xì)管電泳儀QLAxcel、PCR 試劑:購于達(dá)安基因公司。

        1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

        根據(jù)Gen Bank 公布的金黃色葡萄球菌18 種腸毒素的基因序列,利用Primer Premier 5.0 軟件及參考文獻(xiàn)[2],引物由invitrogen 中國公司合成,引物序列見表1。

        1.5 DNA 的提取

        將純培養(yǎng)的菌株用葡萄球菌溶菌酶裂解細(xì)胞壁,用天根細(xì)菌DNA 提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌DNA 的提取。提取物作為PCR 擴(kuò)增的模板。

        1.6 PCR 擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件

        擴(kuò)增反應(yīng)體系:緩沖液5μL、Taq 酶0.25μL、dNTP3μL、引物1μL、模板1μL,再加滅菌去離子水至25μL。

        表1 金黃色葡萄球菌腸毒素基因引物序列

        1.7 毛細(xì)管凝膠電泳

        將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物按順序放入QIAxcel 全自動毛細(xì)管電泳儀96 孔樣品托盤內(nèi),在儀器相應(yīng)位置加入卡夾QIAxcel Gel Cartridge、電泳緩沖液和洗滌液(所有試劑平衡至室溫后使用)。鎖定卡夾,運(yùn)行程序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用軟件BioCalculator 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

        1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        應(yīng)用費(fèi)歇爾精確卡方檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,認(rèn)為P <0.05 時,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果與分析

        22 株金黃色葡萄球菌菌株中檢出19 株攜帶腸毒素基因的菌株,其中攜帶sea 基因的菌株17 株,檢出率77.27%;同時攜帶seb、seg、sei、sem、sen 基因的菌株1 株;同時攜帶seg、sei、sem、sen 的菌株1 株。18種腸毒素基因檢測均為陰性的菌株3 株,占13.64%。食物中毒和食品兩組樣品中腸毒素檢出的陽性率分別為88.23%和80.00%,經(jīng)費(fèi)歇爾精確卡方檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)算累計(jì)概率P=1.835 2,在α=0.05 水平上,認(rèn)為食物中毒和食品兩組攜帶腸毒素基因的概率不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

        表2 兩組樣品中檢出的金黃色葡萄球菌腸毒素陽性率比較

        3 討論

        20 世紀(jì)80 年代有研究表明,由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒中,攜帶sea、seb、sec、sed、see 基因的金黃色葡萄球菌占95%,另外5%由攜帶其它腸毒素基因的金黃色葡萄球菌引起[3]。然而隨著檢測技術(shù)的發(fā)展,樣本來源、基因表達(dá)、毒力強(qiáng)度變化等影響,新發(fā)現(xiàn)的腸毒素基因引起的食物中毒應(yīng)引起重視。為了解新發(fā)現(xiàn)的腸毒素基因在食物中毒中的作用,不僅要對不同來源菌株的各型腸毒素基因分布進(jìn)行系統(tǒng)和深入的研究,而且要研究各型腸毒素基因間的關(guān)系、表達(dá)情況、毒素性質(zhì)。

        從試驗(yàn)結(jié)果可以看出,攜帶sea 腸毒素基因的樣本占總樣本量的77.27%,說明在食品中sea 基因的分布更為集中,這與其它研究中各類食品的金黃色葡萄球菌腸毒素基因分型檢測結(jié)果相似[4]。食品樣本中檢出的金黃色葡萄球菌菌株的腸毒素基因攜帶率較高,并且存在多重?cái)y帶的情況。本試驗(yàn)的22 株金葡菌中2 例攜帶1 種以上腸毒素基因,占9.09%。Janaud 等[5]針對seg、sei 的研究證實(shí),這兩種腸毒素均屬于金葡菌內(nèi)一個名叫腸毒素基因群(Enterotoxin gene cluster,egc)的操縱子,該操縱子位于金黃色葡萄球菌基因島vSAβ 上。Becker等[6]研究表明,egc 與菌株的遺傳背景關(guān)系密切,而與菌株的地域來源及分布無關(guān),因此二者之間可能存在著協(xié)同作用。趙健等[7]用VIDAS 全自動免疫分析儀測定從醫(yī)院食物中毒患者嘔吐物及相關(guān)食品標(biāo)本中分離培養(yǎng)出的金黃色葡萄球菌腸毒素,陽性檢出率為56.20%,低于本試驗(yàn)中的結(jié)果,提示金黃色葡萄球菌腸毒素基因的攜帶與腸毒素蛋白的產(chǎn)生,存在多種因素的影響?;蛟诜g、表達(dá)為蛋白質(zhì)的過程中會受到機(jī)體內(nèi)環(huán)境,以及外界多種因素的影響,因此,盡管檢測出腸毒素基因的存在,但在食品樣本復(fù)雜的環(huán)境因素影響下,并不是每種腸毒素基因都會表達(dá)為具有腸毒素功能的蛋白。蛋白質(zhì)譜分析作為新的研究手段,將成為金黃色葡萄球菌腸毒素蛋白今后探索的方向之一。

        [1]金利宗.細(xì)菌性食物中毒的臨床分析[J].中外健康文摘,2012,9(8):242-243.

        [2]申跡,項(xiàng)錦銀,寇巍,洪蘇玲.慢性鼻—鼻竇炎中金黃色葡萄球菌腸毒素基因研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2012,41(30):3134-3136.

        [3]柳旭偉,葛文霞.金黃色葡萄球菌腸毒素[J].微生物學(xué)雜志,2008,28(5):86-89.

        [4]李自然.上海市食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因多樣性及分型研究[D].上海:上海交通大學(xué),2012.

        [5]Jarraud,Peyrat M A,Lim A,et al.A putative nursery of suoerantigens in Staphyococcus aureus [J].J Immunol,2001,166(1):669-677.

        [6]Becker K,F(xiàn)riendrich A W,Lubritz G.Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantigens and exfoliative toxins among strains of staphylococcus aureus isolated from blood and nasal specimens [J].J Clin Microbiol,2003,41 (4):1434-1439.

        [7]趙健,丁水軍,陸扁,傅丹青.48 株金黃色葡萄球菌的腸毒素分布及其耐藥性研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15(7):841-842.

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