林 兵，于永超，陳 禹，石 勱，楊勤兵

(1中日友好醫(yī)院營養(yǎng)科，北京 100029;2北京清華長庚醫(yī)院臨床營養(yǎng)科/清華大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，北京 102218)

亞急性酒精中毒的病程介于急慢性酒精中毒之間，是慢性酒精中毒的早期損傷，主要表現(xiàn)為肝功能損傷、營養(yǎng)素代謝紊亂和神經(jīng)系統(tǒng)損傷等方面。生物活性肽對(duì)于酒精中毒的保護(hù)作用已有報(bào)道，如玉米寡肽［1］、谷胱甘肽［2］等。本研究采用的膠原多肽(Collagen Peptides，CPs)是一種來源于深海魚皮的寡肽混合物，易吸收、水溶性好、腸胃刺激小、價(jià)格便宜。已有研究顯示，CPs 具有多種生物活性，包括延緩細(xì)胞老化、降血壓、抑制學(xué)習(xí)記憶功能下降、抗衰老等［3］，而對(duì)于酒精中毒領(lǐng)域沒有相關(guān)的報(bào)道。本研究以膠原多肽作為干預(yù)物，觀察其對(duì)連續(xù)4w 攝入酒精大鼠的一般狀況、肝功能、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激水平、乙醇代謝酶等的影響，首次評(píng)價(jià)其對(duì)亞急性酒精中毒大鼠的作用，為膠原多肽的應(yīng)用提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 膠原多肽

膠原多肽為淡黃色粉末狀，相對(duì)分子質(zhì)量在100—860Da，以深海魚的魚皮為主要原料，采用復(fù)合偶聯(lián)酶解技術(shù)生產(chǎn)的小分子多肽混合物，由北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠，雌性，8—10w 齡，體重220—250g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SYXK (京)2011—0039，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21—23℃，濕度50%—60%RH。

1.3 主要試劑和儀器

HITACHI 7180 全自動(dòng)生化分析儀 (日本);肝ADH、組織蛋白(pro)、血清SOD、MDA 檢測(cè)試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供;UV7512GD 型紫外可見分光光度計(jì)，上海欣益儀器儀表有限公司;乙醇和叔丁醇為分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

大鼠按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和CPs 高中低干預(yù)組，模型對(duì)照組12 只，其余每組10 只。乙醇稀釋為50%體積分?jǐn)?shù)的酒精，灌胃劑量為15mL/kg，對(duì)照組蒸餾水灌胃15mL/kg。高中低干預(yù)組在酒精灌胃1h 后分別給予CPs 0.225、0.45 以及0.9g/kg·BW，對(duì)照組給予等劑量蒸餾水，每周稱重調(diào)整灌胃量。

記錄大鼠一般生活狀況和進(jìn)食量，第29d 處死大鼠，股動(dòng)脈取血，分離血清，檢測(cè)ALT、AST、ALB、TB、TC、TG、SOD 和MDA 水平，取部分肝組織檢查ADH 和組織pro 水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以LSD 法行兩兩比較，確定P＜0.05 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)共48 只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，期間模型對(duì)照組和低劑量組各1 只大鼠因灌胃誤嗆入肺而導(dǎo)致死亡，低劑量組和高劑量組各有1 只因不能長期耐受酒精而死亡(長期精神萎靡，解剖肺部無明顯滲出)，其余48 只大鼠均存活。

2.1 大鼠體重變化

攝入酒精后模型對(duì)照組大鼠較正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)差、食欲差、大便多溏瀉、反應(yīng)遲鈍、而且活動(dòng)減少，體重增長緩慢(P＜0.05)，干預(yù)組大鼠的癥狀比模型對(duì)照組輕，體重較模型對(duì)照組有升高的趨勢(shì)，但是不能逆轉(zhuǎn)體重的減輕，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 大鼠體重變化(±s，g)

表1 大鼠體重變化(±s，g)

注:與正常對(duì)照組相比，△P＜0.05

2.2 血清肝功能指標(biāo)

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠血清中ALT、AST 顯著升高(P＜0.05)。與模型對(duì)照組相比，高劑量組大鼠的ALT 水平明顯下降(P＜0.05)，并且各劑量組大鼠血清的AST 水平明顯下降(P＜0.05)(表2)。

表2 大鼠血清中ALT、AST 水平(±s)

表2 大鼠血清中ALT、AST 水平(±s)

注:與正常對(duì)照組相比，△P＜0.05;與模型對(duì)照組相比，* P＜0.05

2.3 血清抗氧化指標(biāo)

模型對(duì)照組大鼠的SOD 水平明顯降低，而血清MDA水平明顯升高(P＜0.05)。與模型對(duì)照組相比，各劑量組大鼠SOD 活性有升高的趨勢(shì)，低劑量組SOD 水平明顯升高(P＜0.05)，其余各組差異無顯著性;低劑量組和中劑量組的MDA 水平比模型對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 大鼠血清中SOD、MDA 水平(±s)

表3 大鼠血清中SOD、MDA 水平(±s)

注:與正常對(duì)照組相比，△P＜0.05;與模型對(duì)照組相比，* P＜0.05

2.4 脂類與蛋白代謝變化

模型對(duì)照組的TG 和TC 含量較正常對(duì)照組明顯升高，而低劑量組和高劑量組大鼠血清TG 含量比模型對(duì)照低，差異有顯著性;高劑量組TC 含量比模型對(duì)照組低，差異有顯著性。模型對(duì)照組的TP 和ALB 與正常對(duì)照組相比無明顯差異，但是A/G 比的差異有顯著性，各劑量干預(yù)組并不能減小這種差異，反而有擴(kuò)大的趨勢(shì)(表4)。

2.5 大鼠肝臟ADH 水平

模型對(duì)照和干預(yù)組組的ADH 活性比正常對(duì)照組高，但各組間差異無顯著性(正常對(duì)照組與模型對(duì)照組間P=0.087)(表5)。

表4 大鼠血清中TG、TC、TP、ALB、GLB 水平及A/G 比(±s)

表4 大鼠血清中TG、TC、TP、ALB、GLB 水平及A/G 比(±s)

注:與正常對(duì)照組相比，△P＜0.05;與模型對(duì)照組相比，* P＜0.05

表5 大鼠肝臟ADH 水平(±s)

表5 大鼠肝臟ADH 水平(±s)

3 討論

本研究采用酒精灌胃造成大鼠亞急性酒精中毒模型，研究CPs 對(duì)于酒精誘導(dǎo)大鼠早期損傷的保護(hù)作用。肝臟為酒精代謝的主要器官，肝損傷是酒精中毒最常見的靶器官，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠一般狀況較差，體重增長緩慢，血清ALT、AST 比空白對(duì)照高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ALT 和AST 是肝細(xì)胞中的正常代謝酶，當(dāng)肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷時(shí)，這兩種轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血清便增多。通過測(cè)定血清轉(zhuǎn)氨酶的活性，即可作為肝細(xì)胞損傷的評(píng)價(jià)指標(biāo)，大鼠轉(zhuǎn)氨酶的升高表明連續(xù)4w 飲酒造成了大鼠肝損傷，CPs 干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)其中的某些變化，干預(yù)組大鼠血清ALT 和AST 水平較模型組降低，提示CPs 具有減輕酒精誘導(dǎo)的肝損傷的作用。進(jìn)一步分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清ALT 的顯著變化常見于各種急性病毒性肝炎、藥物引起急性肝細(xì)胞損傷。相反，在酒精性肝炎中，AST 一般增高至正常值的2—10 倍，而ALT變化幅度較?。?］。結(jié)果顯示，模型組AST 升高的幅度(約2 倍)明顯高于ALT (約1/4)，這可能與酒精性肝炎的發(fā)生有關(guān)，肝臟炎癥反應(yīng)是酒精性肝病的重要病理學(xué)改變［5］，提示CPs 可能具有減輕炎癥反應(yīng)的作用。

目前，關(guān)于酒精中毒的致病機(jī)制仍有待確定，而氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化是普遍認(rèn)可的病因之一［6］。機(jī)體大量攝入乙醇后，抗氧化物質(zhì)消耗增加，而且酒精中毒使得抗氧化酶活性受到抑制，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，早期的主要變化是其主要代謝場(chǎng)所——肝細(xì)胞發(fā)生膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。其中，血清MDA 含量反應(yīng)了機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)4w 攝入酒精后大鼠的SOD 活性下降，血清中MDA 水平升高。某些劑量CPs 干預(yù)使得大鼠SOD 活性升高，MDA 水平下降，表明CPs 可以在一定程度上矯正機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，減輕脂質(zhì)過氧化損害，這也與CPs 之前的研究結(jié)果相符［7］。

長期飲酒會(huì)造成機(jī)體營養(yǎng)素代謝紊亂，脂類代謝異常尤其常見。攝入酒精后大鼠血清TG 和TC 含量明顯升高(P＜0.05)，酒精引起機(jī)體脂類代謝紊亂在以往的研究中已有報(bào)道［4］，而以往研究也發(fā)現(xiàn)，膠原多肽具有改善脂類代謝的作用［8，9］。結(jié)果表明，低劑量和高劑量CPs 干預(yù)后大鼠血清TG 含量明顯降低，高劑量組大鼠TC 含量明顯下降，這表明CPs 具有一定的降血脂作用，這可能是減輕酒精中毒損害的重要機(jī)制。

酒精對(duì)于機(jī)體各組織器官的損傷與時(shí)間、劑量相關(guān)，呈現(xiàn)出蓄積作用，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為誘導(dǎo)酒精中毒早期損傷，以肝損傷、脂代謝異常、氧化應(yīng)激失衡等為主要表現(xiàn)，時(shí)間為4w，沒有觀察到中晚期酒精中毒如嚴(yán)重的代謝紊亂、肝硬化、乙醇代謝酶活性改變等表現(xiàn)。白蛋白由肝細(xì)胞合成，血清白蛋白濃度是肝臟的合成功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)，各種慢性肝病?？梢姷桶椎鞍籽Y［4］。4w酒精灌胃沒有造成大鼠血清白蛋白水平的變化，這表明肝合成功能并沒有受到影響。模型組A/G 比高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，各劑量干預(yù)組并不能減小這種差異，具體的原因尚不清楚，可能與酒精致免疫系統(tǒng)的異常有關(guān)。ADH 是乙醇代謝的特異性酶，在慢性酒精中毒的過程中具有重要的作用，有研究者指出，隨著乙醇的持續(xù)攝入，ADH 的活性會(huì)隨之升高［10］，因此降低ADH的活性是減輕酒精中毒損害的重要機(jī)制，本研究模型對(duì)照組大鼠肝臟內(nèi)的ADH 活性較正常對(duì)照組有一定的升高(t 檢驗(yàn)P=0.087)，而CPs 干預(yù)后ADH 的活性有一定程度的下降，但是差異無顯著性。

綜上所述，CPs 對(duì)于酒精誘導(dǎo)的大鼠早期損傷具有保護(hù)作用，包括減輕肝臟損傷、提高機(jī)體抗氧化水平、改善脂類代謝等，其對(duì)于ADH、蛋白質(zhì)代謝的影響仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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