林 兵,于永超,陳 禹,石 勱,楊勤兵
(1中日友好醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科,北京 100029;2北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科/清華大學(xué)醫(yī)學(xué)中心,北京 102218)
亞急性酒精中毒的病程介于急慢性酒精中毒之間,是慢性酒精中毒的早期損傷,主要表現(xiàn)為肝功能損傷、營(yíng)養(yǎng)素代謝紊亂和神經(jīng)系統(tǒng)損傷等方面。生物活性肽對(duì)于酒精中毒的保護(hù)作用已有報(bào)道,如玉米寡肽[1]、谷胱甘肽[2]等。本研究采用的膠原多肽(Collagen Peptides,CPs)是一種來源于深海魚皮的寡肽混合物,易吸收、水溶性好、腸胃刺激小、價(jià)格便宜。已有研究顯示,CPs 具有多種生物活性,包括延緩細(xì)胞老化、降血壓、抑制學(xué)習(xí)記憶功能下降、抗衰老等[3],而對(duì)于酒精中毒領(lǐng)域沒有相關(guān)的報(bào)道。本研究以膠原多肽作為干預(yù)物,觀察其對(duì)連續(xù)4w 攝入酒精大鼠的一般狀況、肝功能、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激水平、乙醇代謝酶等的影響,首次評(píng)價(jià)其對(duì)亞急性酒精中毒大鼠的作用,為膠原多肽的應(yīng)用提供新的方向。
膠原多肽為淡黃色粉末狀,相對(duì)分子質(zhì)量在100—860Da,以深海魚的魚皮為主要原料,采用復(fù)合偶聯(lián)酶解技術(shù)生產(chǎn)的小分子多肽混合物,由北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供。
SPF 級(jí)SD 大鼠,雌性,8—10w 齡,體重220—250g,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SYXK (京)2011—0039,飼養(yǎng)環(huán)境溫度21—23℃,濕度50%—60%RH。
HITACHI 7180 全自動(dòng)生化分析儀 (日本);肝ADH、組織蛋白(pro)、血清SOD、MDA 檢測(cè)試劑盒,均由南京建成生物工程研究所提供;UV7512GD 型紫外可見分光光度計(jì),上海欣益儀器儀表有限公司;乙醇和叔丁醇為分析純。
大鼠按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和CPs 高中低干預(yù)組,模型對(duì)照組12 只,其余每組10 只。乙醇稀釋為50%體積分?jǐn)?shù)的酒精,灌胃劑量為15mL/kg,對(duì)照組蒸餾水灌胃15mL/kg。高中低干預(yù)組在酒精灌胃1h 后分別給予CPs 0.225、0.45 以及0.9g/kg·BW,對(duì)照組給予等劑量蒸餾水,每周稱重調(diào)整灌胃量。
記錄大鼠一般生活狀況和進(jìn)食量,第29d 處死大鼠,股動(dòng)脈取血,分離血清,檢測(cè)ALT、AST、ALB、TB、TC、TG、SOD 和MDA 水平,取部分肝組織檢查ADH 和組織pro 水平。
所有結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)據(jù)分析采用SPSS15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,以LSD 法行兩兩比較,確定P<0.05 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)共48 只大鼠完成實(shí)驗(yàn),期間模型對(duì)照組和低劑量組各1 只大鼠因灌胃誤嗆入肺而導(dǎo)致死亡,低劑量組和高劑量組各有1 只因不能長(zhǎng)期耐受酒精而死亡(長(zhǎng)期精神萎靡,解剖肺部無明顯滲出),其余48 只大鼠均存活。
攝入酒精后模型對(duì)照組大鼠較正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)差、食欲差、大便多溏瀉、反應(yīng)遲鈍、而且活動(dòng)減少,體重增長(zhǎng)緩慢(P<0.05),干預(yù)組大鼠的癥狀比模型對(duì)照組輕,體重較模型對(duì)照組有升高的趨勢(shì),但是不能逆轉(zhuǎn)體重的減輕,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。
表1 大鼠體重變化(±s,g)
表1 大鼠體重變化(±s,g)
注:與正常對(duì)照組相比,△P<0.05
與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組大鼠血清中ALT、AST 顯著升高(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比,高劑量組大鼠的ALT 水平明顯下降(P<0.05),并且各劑量組大鼠血清的AST 水平明顯下降(P<0.05)(表2)。
表2 大鼠血清中ALT、AST 水平(±s)
表2 大鼠血清中ALT、AST 水平(±s)
注:與正常對(duì)照組相比,△P<0.05;與模型對(duì)照組相比,* P<0.05
模型對(duì)照組大鼠的SOD 水平明顯降低,而血清MDA水平明顯升高(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比,各劑量組大鼠SOD 活性有升高的趨勢(shì),低劑量組SOD 水平明顯升高(P<0.05),其余各組差異無顯著性;低劑量組和中劑量組的MDA 水平比模型對(duì)照組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。
表3 大鼠血清中SOD、MDA 水平(±s)
表3 大鼠血清中SOD、MDA 水平(±s)
注:與正常對(duì)照組相比,△P<0.05;與模型對(duì)照組相比,* P<0.05
模型對(duì)照組的TG 和TC 含量較正常對(duì)照組明顯升高,而低劑量組和高劑量組大鼠血清TG 含量比模型對(duì)照低,差異有顯著性;高劑量組TC 含量比模型對(duì)照組低,差異有顯著性。模型對(duì)照組的TP 和ALB 與正常對(duì)照組相比無明顯差異,但是A/G 比的差異有顯著性,各劑量干預(yù)組并不能減小這種差異,反而有擴(kuò)大的趨勢(shì)(表4)。
模型對(duì)照和干預(yù)組組的ADH 活性比正常對(duì)照組高,但各組間差異無顯著性(正常對(duì)照組與模型對(duì)照組間P=0.087)(表5)。
表4 大鼠血清中TG、TC、TP、ALB、GLB 水平及A/G 比(±s)
表4 大鼠血清中TG、TC、TP、ALB、GLB 水平及A/G 比(±s)
注:與正常對(duì)照組相比,△P<0.05;與模型對(duì)照組相比,* P<0.05
表5 大鼠肝臟ADH 水平(±s)
表5 大鼠肝臟ADH 水平(±s)
本研究采用酒精灌胃造成大鼠亞急性酒精中毒模型,研究CPs 對(duì)于酒精誘導(dǎo)大鼠早期損傷的保護(hù)作用。肝臟為酒精代謝的主要器官,肝損傷是酒精中毒最常見的靶器官,結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠一般狀況較差,體重增長(zhǎng)緩慢,血清ALT、AST 比空白對(duì)照高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ALT 和AST 是肝細(xì)胞中的正常代謝酶,當(dāng)肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷時(shí),這兩種轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血清便增多。通過測(cè)定血清轉(zhuǎn)氨酶的活性,即可作為肝細(xì)胞損傷的評(píng)價(jià)指標(biāo),大鼠轉(zhuǎn)氨酶的升高表明連續(xù)4w 飲酒造成了大鼠肝損傷,CPs 干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)其中的某些變化,干預(yù)組大鼠血清ALT 和AST 水平較模型組降低,提示CPs 具有減輕酒精誘導(dǎo)的肝損傷的作用。進(jìn)一步分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清ALT 的顯著變化常見于各種急性病毒性肝炎、藥物引起急性肝細(xì)胞損傷。相反,在酒精性肝炎中,AST 一般增高至正常值的2—10 倍,而ALT變化幅度較?。?]。結(jié)果顯示,模型組AST 升高的幅度(約2 倍)明顯高于ALT (約1/4),這可能與酒精性肝炎的發(fā)生有關(guān),肝臟炎癥反應(yīng)是酒精性肝病的重要病理學(xué)改變[5],提示CPs 可能具有減輕炎癥反應(yīng)的作用。
目前,關(guān)于酒精中毒的致病機(jī)制仍有待確定,而氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化是普遍認(rèn)可的病因之一[6]。機(jī)體大量攝入乙醇后,抗氧化物質(zhì)消耗增加,而且酒精中毒使得抗氧化酶活性受到抑制,機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài),早期的主要變化是其主要代謝場(chǎng)所——肝細(xì)胞發(fā)生膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。其中,血清MDA 含量反應(yīng)了機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,連續(xù)4w 攝入酒精后大鼠的SOD 活性下降,血清中MDA 水平升高。某些劑量CPs 干預(yù)使得大鼠SOD 活性升高,MDA 水平下降,表明CPs 可以在一定程度上矯正機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài),減輕脂質(zhì)過氧化損害,這也與CPs 之前的研究結(jié)果相符[7]。
長(zhǎng)期飲酒會(huì)造成機(jī)體營(yíng)養(yǎng)素代謝紊亂,脂類代謝異常尤其常見。攝入酒精后大鼠血清TG 和TC 含量明顯升高(P<0.05),酒精引起機(jī)體脂類代謝紊亂在以往的研究中已有報(bào)道[4],而以往研究也發(fā)現(xiàn),膠原多肽具有改善脂類代謝的作用[8,9]。結(jié)果表明,低劑量和高劑量CPs 干預(yù)后大鼠血清TG 含量明顯降低,高劑量組大鼠TC 含量明顯下降,這表明CPs 具有一定的降血脂作用,這可能是減輕酒精中毒損害的重要機(jī)制。
酒精對(duì)于機(jī)體各組織器官的損傷與時(shí)間、劑量相關(guān),呈現(xiàn)出蓄積作用,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為誘導(dǎo)酒精中毒早期損傷,以肝損傷、脂代謝異常、氧化應(yīng)激失衡等為主要表現(xiàn),時(shí)間為4w,沒有觀察到中晚期酒精中毒如嚴(yán)重的代謝紊亂、肝硬化、乙醇代謝酶活性改變等表現(xiàn)。白蛋白由肝細(xì)胞合成,血清白蛋白濃度是肝臟的合成功能的評(píng)價(jià)指標(biāo),各種慢性肝病??梢姷桶椎鞍籽Y[4]。4w酒精灌胃沒有造成大鼠血清白蛋白水平的變化,這表明肝合成功能并沒有受到影響。模型組A/G 比高于正常對(duì)照組(P<0.05),各劑量干預(yù)組并不能減小這種差異,具體的原因尚不清楚,可能與酒精致免疫系統(tǒng)的異常有關(guān)。ADH 是乙醇代謝的特異性酶,在慢性酒精中毒的過程中具有重要的作用,有研究者指出,隨著乙醇的持續(xù)攝入,ADH 的活性會(huì)隨之升高[10],因此降低ADH的活性是減輕酒精中毒損害的重要機(jī)制,本研究模型對(duì)照組大鼠肝臟內(nèi)的ADH 活性較正常對(duì)照組有一定的升高(t 檢驗(yàn)P=0.087),而CPs 干預(yù)后ADH 的活性有一定程度的下降,但是差異無顯著性。
綜上所述,CPs 對(duì)于酒精誘導(dǎo)的大鼠早期損傷具有保護(hù)作用,包括減輕肝臟損傷、提高機(jī)體抗氧化水平、改善脂類代謝等,其對(duì)于ADH、蛋白質(zhì)代謝的影響仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。
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