譚明芳，張正昊，劉 洋，陳 雙，余靜靜，曲建華

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液科，烏魯木齊830054）

慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）是一種發(fā)生于造血組織的惡性腫瘤。腫瘤細胞形態(tài)為類似正常成熟的小淋巴細胞，是單克隆的B淋巴細胞，蓄積于血液、脾臟、骨髓和淋巴組織中。CLL 的發(fā)病率在不同地域有很大差別，在歐洲和北美地區(qū)，CLL 是最常見的白血病，占所有白血病總數的25%～40%，為CML 的2 倍；而在亞洲地區(qū)，CLL僅占白血病的5%以下，據報道中國為1.26%～3.5%［1］。本研究通過對CLL細胞遺傳學異常的研究，同時結合相關臨床資料，研究細胞遺傳學異常與臨床資料的相關性。本研究對47例初診和隨訪的患者，運用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）檢測技術，以ATM（11q22.3）、TP53（17p13.1）、RBI（13q14）、CEP12（12-三體）探針檢測染色體的缺失情況，但各種預后指標均有其局限性。在FISH 檢測的基礎上聯合患者免疫分型、流式細胞學等相關指標綜合分析比較，探討細胞遺傳學異常與其他預后指標的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究對象為2012年12月至2014年2月在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液中心住院和門診收治的47例CLL 患者。其中，男33例（70.21%），女14例（29.79%），男∶女之比為2.36∶1；年齡44～84歲，中位年齡65.1歲，其中，60歲以上者28例；初診患者18例。本研究經新疆醫(yī)科大學倫理學委員會批準，所有受試者均在實驗前告知相關事宜并簽署知情同意書。全部患者的臨床表現、血象和骨髓象均符合張之南主編的《血液病診斷及療效標準》標準（第3版）。用Binet分期方法進行臨床分期，其中，A 期10例（21.28%），B 期25例（53.19%），C期12例（25.53%）；白細胞（6.26～150.97）×109／L，平均為56.1×109／L，淋巴細胞（53～150.15）×109／L，平均為44.84×109／L，血紅蛋白56～158g／L，平均為115.58g／L，血小板（36～315）×109／L，平均為127.12×109／L，乳酸脫氫酶100.57～683U／L，平均為201.82U／L，β2微球蛋白1.7～8.2g／L，平均為4.43g／L，ZAP70（＋）為18／32（56.25%），CD38（＋）為7／32（21.88%），IGVH（＋）為13／32（40.63%），淋巴結腫大40例（85.1%），肝大4例（8.5%），脾大7例（14.9%）；治 療29 例（61.7%），29 例 治 療 者 中3 例（6.38%）死亡；治療方式為瘤可燃治療9例（19.14%），FC 治療13例（27.66%），FMR 治療3例（6.38%）；未治療者18例（38.3%）。本研究患者白細胞計數和β2微球蛋白都偏高，Binet B、C 期的患者較多，可能跟本院收治的危重患者較多有關。

1.2 免疫表型檢測 采用肝素抗凝的骨髓或外周血，經患者簽署同意書后統(tǒng)一外送檢查，47例患者中僅32例外送檢查，另外15例未完成此項檢查。

1.3 染色體標本制備 所有患者于初診時取肝素抗凝的骨髓或外周血，先進行有核細胞計數，以（1～3）×106的密度接種到小牛血清中，加有絲分裂原刺激劑，37 ℃培養(yǎng)箱過夜，16～24h后，加入秋水仙堿，經低滲、反復固定處理后提取細胞，氣干法滴片，Ginema液染色，在油鏡下觀察20個左右的中期分裂相細胞，核型描述根據《人類細胞遺傳學命名體制（ISCN1995）》。此標本置于-20 ℃冰箱保存。該標本同時可以做為FISH 研究用。

1.4 FISH 取出預先處理好的標本，用新鮮的固定液固定，氣干法滴片，在55 ℃的恒溫加熱平臺，加熱30min，按照說明書的標準步驟操作，配好探針和緩沖液，立即加于玻片的指定區(qū)域內，玻片用Rubber Cement封膠，在75 ℃的恒溫加熱平臺上變性90s，后置于濕盒中在37℃培養(yǎng)箱內過夜，16～28h后經70%、85%、100%乙醇梯度脫水后晾干，經4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復染。探針的閾值的算法為：抽取15個健康者的外周血作為對照，算出外周血的均數（）和標準差（s）按x±3s計算［2］。4種探針（均購自美國Vysis公司）的閾值：12-三體為4.8%，13q-為5.1%，17p-為4.4%，11q-為4.6%。用Lecia DM6000B 型 號 的 熒 光 顯 微鏡在DAPI／SpectrumOrange雙色濾光鏡下進行觀察，觀察細胞分裂間期的綠色和桔紅色雜交信號，每例至少對300個邊界無重疊、結構完整的間期細胞進行計數，使用Lecia-CW4000FISH 軟件進行圖像采集。

1.5 研究方法 回顧性分析47 例患者的臨床資料，包括：CLL的臨床Binet分期及實驗室檢查結果，如乳酸脫氫酶、CD38、IgVH、ZAP70等。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，染色體異常和臨床指標的相關性分析采用Pearson列連分析，常規(guī)染色體顯帶技術（conventional cytogenetics，CC）和FISH 技術二者的比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 細胞遺傳學異常結果 47例患者中8例（17.02%）通過CC檢測到細胞遺傳學異常，10例未見中期分裂相，余29例為正常核型。這8例患者的樣本同時用于FISH 檢測，有6例發(fā)生細胞遺傳學改變。染色體常規(guī)顯帶技術和FISH 檢測比較見表1。

表1 CC和FISH 檢測的差異（n＝47）

通過χ2檢驗得χ2＝23.18，P＜0.05，兩種檢測方法比較差異有統(tǒng)計學意義。FISH 檢測的具體染色體異常的結果為：4種探針在15例健康者作為對照的細胞中都表現為2個橘紅色信號，除了12-三體異常在熒光顯微鏡下為3個桔紅色信號點外，余探針的細胞遺傳學異常都表現為只有1 個信號點。13q-有19例（40.42%），異常細胞的百分比為15.09%～98.26%，其中，2例合并11q-，1 例患者初診中白細胞計數為150.4×109／L，血紅蛋白108g／L，有多發(fā)淋巴結腫大伴脾大，給予FC方案化療后呈部分緩解。12-三體有6例（12.77%），異常細胞的百分比為25.4%～78.54%。有2例合并有12-三體，11q-者4 例（8.5%），異常細胞的百分比為16.78%～95.54%；17p-有2 例（4.25%），異常細胞的百分比為14.37%～22.38%，1例合并有13q-伴有陽性細胞比較高，其中，1例治療后部分緩解，合并復雜細胞遺傳學病情呈進行性加重致死亡，見表2。

表2 間期熒光原位雜交染色體異常情況

2.2 FISH 檢測出的染色體異常與其他預后指標相關性的分析 比較FISH 檢測出的染色體異常與不同的預后指標（CD38、ZAP70、IgVH）的關系。根據染色體缺失的差異導致的預后不同，將正常核型和13q-分到低危組，12-三體分到中危組，11q-、17p-和復雜細胞學異常分到高危組，見表3。

表3 FISH 檢測出的染色體異常與CD38、 ZAP70、IgVH 的關系

續(xù)表3 FISH 檢測出的染色體異常與CD38、 ZAP70、IgVH 的關系

從表3可知，Pearson列連分析提示，CD38、IgVH 在不同預后的染色體中的分布有差異（r＝0.486，P＝0.012vsr＝0.510，P＝0.013），相關性提示CD38 在高危組的分布較高，IgVH 在低危組的分布越高。ZAP-70、Rai分期、β2微球蛋白、年齡在預后不同的染色體中分布無差異。

3 討 論

CLL一直以來作為一種生物學行為和臨床進程高度可變的疾病，細胞遺傳學不同的患者臨床預后不同。目前，通過CC只有20%可檢測到染色體的異常，但CC因只能檢測到分裂中期相細胞中的染色體，在臨床上的應用受到限制，即使加用有絲分裂原刺激后也僅有50%的CLL 可檢測到異常，但增加有絲分裂原刺激劑并未應用到所有的實驗室中。國內曾有使用不同的有絲分裂原刺激后導致常規(guī)染色體檢測的有效率不同的報道［3］。本實驗不排除有絲分裂原刺激劑對檢測結果的影響。FISH 是現今在間期核和中期核相上檢測特定DNA 序列的新技術，超過80%的CLL 患者可檢測到基因組異常，大大提高了CLL的基因異常檢出率。本實驗CC 檢測率為17%，與同期報道的20% 基本相符。FISH 檢測的有效率為66.96%，低于相關報道的80%，可能與本實驗樣本量偏小有關。但FISH 檢測的細胞遺傳學陽性率明顯高于CC，與文獻報道相符。

本實驗發(fā)現CD38、IgVH 在不同預后染色體中的分布有差異（P＝0.012vsP＝0.013），差異有統(tǒng)計學意義，其他預后指標在預后不同的染色體中分布無差異。CD38是一種能促使B細胞增殖和活化的Ⅱ類跨膜糖蛋白，是一項獨立的CLL預后指標，CD38 隨著疾病的惡化會發(fā)生相應的變化［4］。而IgVH 突變的患者較無IgVH 突變的患者更顯惰性，因為CLL逃避IgVH 可以獲得抗原持續(xù)刺激促使腫瘤克隆增殖［5］。本實驗12例中、高危預后的患者，有50%的患者CD38陽性，而IgVH 在低危組的陽性率明顯高于中、高危預后組（60%vs8.3%），與文獻報道一致。

國外Puiggros等［6］報道627 例多中心研究中，對其中的84例CLL患者進行了FISH 的隨訪，有8例患者逐漸發(fā)展成13q缺失，同時該報道還發(fā)現用FISH 檢測的遺傳學異常的細胞數目大于90%時，可以對5年累計發(fā)病率和總生存率產生重大影響。本研究復雜細胞遺傳學異常中有1例患者給予瘤可燃治療后出現病情進展，淋巴結進行性增大，再次行FISH檢測除了原有的11q-外，還出現了13q-的缺失。本實驗發(fā)現有2例13q-患者陽性細胞的百分率都大于90%，這2例患者化療后呈部分緩解，與Puiggros等報道的相符，但由于樣本偏小，暫無統(tǒng)計學意義。提示這些遺傳學異常并不是一成不變的，而是隨著病程的進展逐漸發(fā)生著微小的變化，作者可以在今后的研究中加強對FISH 的隨訪。Puiggros等研究還發(fā)現13q廣泛大片段涉及RB1基因缺失的預后較差，治療的反應時間和OS較短，因為在CLL的發(fā)病機制中，他們有可能抑制腫瘤細胞的增殖，這也許就是大部分13q-的患者與正常核型患者預后相同的原因，具體機制尚未研究清楚。本研究CD38與13q-低表達相關，此研究結論與以往資料具有一致性。

有文獻報道11q-的檢出率為10%～20%［7］，本研究為8.5%，與文獻報道相符。11q-異常的患者往往表現淋巴結腫大［8］，本研究4例患者中有3例初診時有多發(fā)淋巴結腫大，與文獻報道相符。FISH 相關研究的文獻表明，11q-缺失常累及的2～3 Mb的最小區(qū)域中包含有ATM 基因（ataxia telangiectasia muted），ATM 基因的產物是ATM 蛋白，ATM 蛋白是對損傷的DNA 雙鏈進行修復途徑中P53蛋白的激活劑，當11q-細胞遺傳學異常出現時，P53蛋白調節(jié)途徑受阻，CLL 腫瘤細胞開始增殖［9］。17p-在本實驗的檢出率為4.25%，與同期文獻報道的相符，TP53定位于17p，國外Stilgenbauer等［7］報道有TP53缺失的患者對嘌呤類似物治療效果不佳，而無TP53缺失的患者治療的反應率為56%。本研究2例17p-患者1例給予FC治療后呈部分緩解，1例死亡，與文獻報道相符。11q-和17p-被歸入高危組，CD38在高危組中陽性率較高，與文獻報道高危組疾病進展快相符。國外Rossi等［8］對104 例已經存在17p-的患者進行了逆轉錄聚合酶鏈反應，發(fā)現microRNAs（miRNA）在17p-缺失的患者和正常核型的患者中分布不同，miR-181b在對嘌呤類似物耐藥的患者中會下調［10］。因此，17p-可以納入初診CLL 患者評估病情的重要指標。有報道稱，12-三體與分期級別高、淋巴細胞增殖活性高、生存時間和預后有關，這種異常的發(fā)生率為15%～23%。本研究12-三體的發(fā)生率為12.77%，與文獻報道相符，12-三體容易向Richter綜合征（richter′s syndrome，RS）轉化，本研究未發(fā)現RS患者。

FISH 代表了細胞遺傳學技術和分子遺傳學技術的一種融合，這類逐漸成熟的技術是臨床上檢測和某些臨床表現相關的基因組亞微觀變化微缺失綜合征和微復制綜合征的最佳選擇［10］。隨著血液實驗室檢測技術的提高，評價預后指標逐漸增多，FISH 技術不受細胞分裂相的影響，細胞遺傳學異常檢出率較CC高，而越來越多的研究表明遺傳學異常具有重要的判斷預后的價值，這些遺傳學異常并不是固定不變的，而是隨著病程的進展逐漸發(fā)生著微小的變化，作者可以把FISH 逐漸納入動態(tài)隨訪中，進行大規(guī)模前瞻性研究，同時聯合CD38、IgVH 等指標綜合評估患者病情從而進一步指導治療。

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