李高申　郭梅珍　趙唯賢(黃河科技學(xué)院，河南　鄭州　450006)

逍遙散對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬mRNA 表達(dá)的影響

李高申郭梅珍趙唯賢1
(黃河科技學(xué)院，河南鄭州450006)

〔摘要〕目的探討疏肝理氣方劑逍遙散對(duì)阿爾茨海默病(AD)模型大鼠海馬mRNA表達(dá)的影響。方法將4～5個(gè)月鼠齡，體重(250± 20) g的清潔級(jí)SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組，其中模型組、西藥組、中藥組采用D-gal腹腔注射和Aβ1～42雙側(cè)海馬注射聯(lián)合造模;生理組采用等體積滅菌生理鹽水按上述方法象征性造模。造模完成后，生理組、模型組以生理鹽水灌胃，西藥組和中藥組分別采用奧拉西坦溶液和逍遙散煎劑灌胃。四組均每日1次，連續(xù)灌胃28 d，用藥體積0.5 ml/100 g。結(jié)果經(jīng)灌胃干預(yù)后，中藥組水迷宮成績(jī)較模型組提高明顯(P＜0.01) ;大鼠海馬中蛋白磷酸酶-2A基因表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，細(xì)胞依賴性蛋白激酶-5、糖原合成酶激酶-3β的基因表達(dá)明顯減少(P＜0.01)。結(jié)論逍遙散通過(guò)上調(diào)蛋白磷酸酶-2A基因表達(dá)和下調(diào)細(xì)胞依賴性蛋白激酶-5、糖原合成酶激酶-3β基因表達(dá)，對(duì)凝聚態(tài)Aβ1～42peptide誘導(dǎo)的海馬Tau蛋白過(guò)度磷酸化有一定抑制作用，對(duì)大鼠AD模型記憶能力的改善起到了一定影響。

〔關(guān)鍵詞〕逍遙散;阿爾茨海默病;糖原合成酶激酶-3β;細(xì)胞依賴性蛋白激酶-5;蛋白磷酸酶-2A

1河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校

第一作者:李高申(1971-)，男，碩士，副教授，主要從事中醫(yī)教學(xué)與基礎(chǔ)研究。

阿爾茨海默病(AD)是以漸進(jìn)性記憶、認(rèn)知功能障礙為特點(diǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)是AD的重要病理學(xué)特征。本研究擬觀察逍遙散對(duì)調(diào)控AD Tau蛋白過(guò)度磷酸化相關(guān)蛋白激酶及蛋白磷酸酶基因表達(dá)水平的影響，旨在為篩選有效抗AD中藥提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物清潔級(jí)SD雄性大鼠，鼠齡4～5個(gè)月，體重(250± 20) g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào): SCXX(豫) 2010-0002。

1.2藥物逍遙散煎劑(組成:柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、炙甘草、生姜、薄荷)各藥間質(zhì)量比例按原方10∶10∶10∶10∶10∶5∶1∶1配比，由本課題組在每日用藥前2 h，嚴(yán)格按照中藥煎劑制備流程自行制作，最后經(jīng)水浴箱蒸發(fā)濃縮至含生藥2 g/ml的藥液濃度，晾至常溫備用。奧拉西坦膠囊(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司提供，400 mg/粒，批號(hào): 05110703)，用藥前，將奧拉西坦藥粉用常溫蒸餾水稀釋成150 mg/ml的奧拉西坦溶液備用。

1.3試劑D-半乳糖(D-gal)，Genview公司生產(chǎn)，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司分裝，批號(hào)22L10133;β-淀粉樣蛋白(Aβ) 1～42，北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào): 990901;海馬蛋白磷酸酶(PP) -2A抗體，abgent生產(chǎn)，編號(hào)AJ1644a;糖原合成酶激酶(GSK) -3β抗體，GST生產(chǎn)，編號(hào)9315s。

1.4儀器藍(lán)星B型腦立體定位儀2H，安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn); DMS2型Morris水迷宮系統(tǒng)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生產(chǎn);潔凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠; DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.5方法

1.5.1動(dòng)物分組全部大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，光照節(jié)律12 L: 12 D(6∶00～18∶00)，室溫22℃～24℃，濕度30％～40％，自由飲水，喂食河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的普通大鼠顆粒飼料。將每只大鼠用苦味酸進(jìn)行染色標(biāo)記，水迷宮連續(xù)訓(xùn)練3 d，留用尋找平臺(tái)平均時(shí)間較短者作為實(shí)驗(yàn)用鼠，并隨機(jī)分為四組(生理組、模型組、西藥組、中藥組)，每組7只。

1.5.2模型制備模型組、西藥組、中藥組均采用D-gal腹腔注射和Aβ1～42雙側(cè)海馬注射聯(lián)合造模〔1〕:①每天9∶00～10∶00，按1 ml/100 g的劑量分別對(duì)各組大鼠腹腔注射D-gal溶液(濃度10 mg/ml)，連續(xù)42 d;②將Aβ1～42加生理鹽水稀釋成5 μg/μl的溶液，震蕩溶解，密封，37℃溫箱中孵育7 d，使其變?yōu)槟蹜B(tài)Aβ，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?。自D-gal造模次日(第43天)，大鼠經(jīng)10％水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上，常規(guī)皮膚消毒，頭部正中矢狀切口，以前囟為基準(zhǔn)點(diǎn)，后移4 mm，左右旁移2 mm，確定左右側(cè)海馬注射點(diǎn)。用牙科鉆在海馬注射點(diǎn)鉆開(kāi)顱骨，暴露硬腦膜，用微量注射器針頭進(jìn)入大腦1.6 mm到達(dá)海馬組織。在20 min內(nèi)將2 μl Aβ緩慢注入雙側(cè)海馬，以保證溶液充分彌散。然后緩慢撤針，以滅菌骨蠟填補(bǔ)骨孔，縫合皮膚，碘伏消毒。每只腹腔注射青霉素鈉預(yù)防感染，1次/d，連用3 d。常規(guī)飼養(yǎng)。生理組用等體積滅菌生理鹽水做上述操作完成造模。

1.5.3藥物干預(yù)造模結(jié)束后的第4天，每日9∶00～11∶00進(jìn)行藥物灌胃干預(yù)。生理組、模型組采用生理鹽水灌胃，西藥組和中藥組分別采用奧拉西坦溶液和逍遙散煎劑灌胃。各組均每日1次，連續(xù)28 d，用藥體積均為0.5 ml/100 g。

1.5.4行為學(xué)檢測(cè)〔2〕各組在藥物干預(yù)結(jié)束后的次日，再次進(jìn)行水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。大鼠分別自第1～4象限放入，觀察并記錄各象限大鼠從入水到找到安全平臺(tái)所用的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)每日1次，連續(xù)實(shí)驗(yàn)3 d，取其3 d的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

1.6取材及實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1取材行為學(xué)測(cè)試結(jié)束，各組經(jīng)10％水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔麻醉，斷頭，在超凈臺(tái)內(nèi)冰塊上迅速剝離海馬，分別放入1.5 ml滅菌離心管內(nèi)，密封并標(biāo)記，埋入干冰，迅速轉(zhuǎn)移至－70℃低溫冰箱中保存。

1.6.2RNA抽提和質(zhì)量檢測(cè)從少量組織(1～10 mg)或細(xì)胞(102～104)樣品中抽提RNA，加入800 μl TRIZOL試劑至樣品中，樣品裂解后，加氯仿兩相分離。質(zhì)量檢測(cè)主要采用紫外吸收測(cè)定法和變性瓊脂糖凝膠電泳法〔3〕。

1.6.3引物設(shè)計(jì)由上?？党缮锕こ坦竞铣?，GSK-3β正義引物: 5＇CCGCCCGGCTAACACCACTG 3＇，反義引物: 5＇GTGCTGGTCTTTCCCGCGCA 3＇，退火溫度60℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度326 bp; cdk-5正義引物: 5＇CCGGGGCCGGGAGTCTTAGAA3＇，反義引物: 5＇CCGGAGGGCTGAACTTGGCAC3＇，退火溫度60℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度204 bp; PP-2A正義引物: 5＇TGAGCTGCCTGCAGAAATGTAAGGC 3＇，反義引物: 5＇TCTGCAGAGCTGGGAAGCCCAA 3＇，退火溫度60℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度96 bp; GAPDH正義引物: 5＇GGAAAGCTGTGGCGTGAT3＇，反義引物: 5＇AAGGTGGAAGAATGGGAGTT3＇，退火溫度59℃，產(chǎn)物長(zhǎng)度308 bp。

1.6.4實(shí)時(shí)定量PCR方法將所有cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應(yīng)體系，配置: dNTP(每個(gè)2.5 mmol/L) 1.0 μl，10×PCR緩沖液1.0 μl，MgCl2溶液0.6 μl，Taq聚合酶0.5 U，10 μmol/L的PCR特異引物各0.4 μl，2×ROX Reference Dye 0.2 μl，加水至總體積為8 μl。將384-PCR板置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng): GAPDH: 95℃，3 min; 40個(gè)PCR循環(huán)〔95℃，15 s; 59℃，20 s; 72℃，20 s; 83℃，20 s(收集熒光)〕。PP-2A: 95℃，3 min; 40個(gè)PCR循環(huán)〔95℃，15 s; 60℃，20 s; 72℃，20 s; 81℃，20 s(收集熒光)〕。GSK-3β: 95℃，3 min; 40個(gè)PCR循環(huán)〔95℃，15 s; 60℃，20 s; 72℃，20 s; 86℃，20 s(收集熒光)〕。cdk-5: 95℃，3 min; 40個(gè)PCR循環(huán)〔95℃，15 s; 60℃，20 s; 72℃，20 s; 83℃，20 s(收集熒光)〕。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.5軟件行單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)生理組與模型組比較水迷宮成績(jī)占明顯的優(yōu)勢(shì)〔(12.18±1.68) s vs(18.63±1.71) s〕(P＜0.01)。藥物干預(yù)后，西藥組〔(15.09±2.69) s〕、中藥組〔(14.66±2.78) s〕與模型組比較，水迷宮成績(jī)提高明顯(P＜0.01)。

2.2海馬相關(guān)指標(biāo)mRNA的表達(dá)與生理組比較，模型組PP-2A表達(dá)減少(P＜0.01)，細(xì)胞依賴性蛋白激酶-5(cdk-5)、GSK-3β表達(dá)增多(P＜0.01) ;與模型組比較，中藥組海馬PP-2A表達(dá)增多(P＜0.01)，cdk-5、GSK-3β表達(dá)減少(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1　各組海馬相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)的相對(duì)含量比較(±s)

表1　各組海馬相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)的相對(duì)含量比較(±s)

與生理組比較: 1) P＜0.01;與模型組比較: 2) P＜0.01

組別　PP-2A/GAPDH　 cdk-5/GAPDH　 GSK-3β/GAPDH生理組　0.308 3±0.017 5　 0.106 2±0.004 5　 0.083 0±0.004 2模型組0.096 3±0.006 81)0.309 5±0.000 91)　0.267 7±0.013 51)西藥組0.160 3±0.003 72)0.208 4±0.009 42)　0.162 2±0.008 92)中藥組0.237 8±0.004 62)0.186 2±0.008 52)　0.125 9±0.009 12)

3　討論

AD患病率隨年齡增高而增高。在發(fā)達(dá)國(guó)家，AD已成為繼心臟病、癌癥、中風(fēng)后的第四位死因。有資料顯示，我國(guó)現(xiàn)有約500萬(wàn)AD患者〔4〕。隨著人類平均壽命的延長(zhǎng)和人口老齡化的出現(xiàn)，AD對(duì)人類健康的危害將變得日益突出。

Aβ是老年斑(SP)的主要成分，其大量沉積可能是所有因素引起AD的共同途徑。Aβ的神經(jīng)毒性作用已被公認(rèn)為是AD形成的核心環(huán)節(jié)，減少Aβ的形成、抑制Aβ的沉積，是預(yù)防和治療AD的根本途徑〔5〕。

tau蛋白的病理變化出現(xiàn)在AD早期，有資料顯示大多數(shù)病人腦脊液中的tau蛋白升高，而量化測(cè)定腦脊液中的tau蛋白可能成為AD早期診斷的一項(xiàng)有用指標(biāo)〔6〕。CDK-5和GSK-3β屬于蛋白激酶，其活性的增加可使tau蛋白發(fā)生異常磷酸化。CDK-5基因在大鼠腦組織中的過(guò)量表達(dá)常導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)AD樣tau過(guò)度磷酸化和空間記憶障礙〔7〕;而PP-2A屬于蛋白磷酸酯酶，在信號(hào)傳導(dǎo)中承擔(dān)負(fù)性調(diào)節(jié)作用，其活性增加可使過(guò)度磷酸化的tau蛋白發(fā)生去磷酸化〔8〕。本研究結(jié)果也表明了PP-2A基因表達(dá)形式與CDK-5、GSK-3β基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

中醫(yī)臨床將AD歸屬于呆病門類，其發(fā)病和心、肝、脾、腎都有密切聯(lián)系，目前較多的研究主要集中在腎功能失調(diào)方面，多采用補(bǔ)腎益智方藥治療〔9〕。但是，肝在癡呆發(fā)病中也居重要地位。肝疏泄功能失常，肝氣郁滯，失其調(diào)達(dá)之性，其調(diào)節(jié)情志、調(diào)暢氣機(jī)功能障礙，氣血運(yùn)行不暢，可導(dǎo)致健忘(癡呆)。如《素問(wèn)·玉機(jī)真臟論》曰:“春脈如弦，......太過(guò)則令人善忘，忽忽眩暈而巔疾”。陳士鐸在《辨證錄》中指出，“人有氣郁不舒，忽忽如有所失，目前之事竟不記憶，一如老人之善忘，此乃肝氣之滯，非心腎之虛耗也”。疏肝理氣法可以運(yùn)用到記憶、認(rèn)知障礙疾病的臨床治療中〔10〕。

逍遙散是肝郁血虛，脾失健運(yùn)的重要方劑。方中有柴胡疏肝解郁，當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血柔肝，白術(shù)、茯苓健脾去濕，炙甘草益氣補(bǔ)中，生姜溫胃和中，薄荷助柴胡疏肝解郁，體現(xiàn)了肝脾同治，重在治肝之法?，F(xiàn)代研究表明，柴胡能改善腦細(xì)胞代謝和腦循環(huán)，延緩衰老引起的活性氧自由基的反應(yīng)速度;當(dāng)歸對(duì)腦缺血引起的空間認(rèn)知障礙有一定改善作用;白芍總苷能改善東莨菪堿誘發(fā)的小鼠空間識(shí)別障礙;茯苓長(zhǎng)期服用可使老齡大鼠內(nèi)在性膽堿和乙酰輔酶-A的含量增加，有抑制抗膽堿的作用。以疏肝解郁為主治療AD，除有助于改善患者的記憶力減退等癥狀外，還可顯著改善其情緒抑郁、反應(yīng)遲鈍的狀態(tài)，這對(duì)于減輕進(jìn)一步的智能損害、防止病情加重具有重要的臨床意義〔11〕。

綜上，逍遙散改善了模型大鼠的認(rèn)知障礙。逍遙散可能上調(diào)PP-2A的表達(dá)和下調(diào)CDK-5、GSK-3β的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)凝聚態(tài)的Aβ1～42誘導(dǎo)的海馬Tau蛋白過(guò)度磷酸化起到了一定的抑制作用，對(duì)AD模型大鼠起到了一定的治療作用。

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〔2015-03-17修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:郭梅珍(1971-)，女，講師，主要從事中醫(yī)藥教學(xué)與基礎(chǔ)研究。

基金項(xiàng)目:河南省2012年度科技計(jì)劃項(xiàng)目(No．122102310410) ;河南省教育廳青年骨干教師資助項(xiàng)目(No．2011GGJS-220)

〔中圖分類號(hào)〕R749

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 15-4199-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.039