朱志軍　薛亞軍　朱佳龍(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科，新疆　石河子　832000)

miRNA-182通過調(diào)節(jié)EMT 相關(guān)分子ZEB2而抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲

朱志軍薛亞軍朱佳龍
(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科，新疆石河子832000)

〔摘要〕目的探討微小RNA(miRNA) -182對肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法采用熒光定量PCR方法檢測肺癌細(xì)胞系和組織標(biāo)本中miRNA-182表達(dá)情況;對miRNA-182表達(dá)情況與肺癌臨床病理特征關(guān)系進(jìn)行分析;通過Boyden小室分析和傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測miRNA-182對肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響;生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA-182可能的靶基因，并采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證預(yù)測的靶基因E盒結(jié)合鋅指蛋白2(ZEB2)是miRNA-182的靶基因; Western印跡方法檢測ZEB2、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果四種肺癌細(xì)胞系miRNA-182 mRNA的表達(dá)情況為高轉(zhuǎn)移能力的肺癌細(xì)胞系95D和L9981其miRNA-182 mRNA表達(dá)顯著低于轉(zhuǎn)移能力較弱的肺癌細(xì)胞系NL9980或95C(P＜0.05)，且同原發(fā)性肺癌組織相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中miRNA-182表達(dá)亦顯著下調(diào)(P＜0.05) ;臨床病理特征關(guān)系分析結(jié)果顯示，miRNA-182表達(dá)僅與是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。轉(zhuǎn)染miRNA-182可顯著抑制肺癌細(xì)胞系95D和L9981的轉(zhuǎn)移(P＜0.05)，同時(shí)，轉(zhuǎn)染miRNA-182可顯著抑制肺癌細(xì)胞系95D和L9981的侵襲能力(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染miRNA-182抑制劑可增加肺癌細(xì)胞系95D和L9981的侵襲能力(P＜0.05)。生物信息學(xué)預(yù)測顯示ZEB2為miRNA-182的功能性靶基因，且得到熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)。Western印跡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-182可顯著抑制肺癌細(xì)胞系95D和L9981中ZEB2和波形蛋白的表達(dá)，上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)。結(jié)論miRNA-182可通過調(diào)節(jié)ZEB2、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。

〔關(guān)鍵詞〕肺癌; miRNA-182 ;細(xì)胞轉(zhuǎn)移;細(xì)胞侵襲; E盒結(jié)合鋅指蛋白2

第一作者:朱志軍(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心胸外科相關(guān)疾病。

微小RNA(microRNA，miRNA)可在轉(zhuǎn)綠后水平對基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控〔1〕。miRNA在許多生物過程，包括發(fā)育、分化、凋亡、代謝、免疫和腫瘤進(jìn)展中具有重要的作用。越來越多的證據(jù)表明，miRNA可調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲中具有重要的作用〔2，3〕。因此，miRNA可能參與調(diào)解肺癌的發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。然而，關(guān)于miRNA-182在肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用及相關(guān)機(jī)制尚未明確。本研究通過觀察肺癌細(xì)胞和組織標(biāo)本中miRNA-182表達(dá)情況，分析其與肺癌臨床病理特征的關(guān)系，并在體外轉(zhuǎn)染miRNA-182后觀察肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的變化，驗(yàn)證miRNA-182的靶基因E盒結(jié)合鋅指蛋白2(ZEB2)，檢測miRNA-182對ZEB2、E-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)而探討miRNA-182在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑人肺癌細(xì)胞系NL9980和L9981由四川大學(xué)華西醫(yī)院四川省肺癌分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，95C和95D由上海復(fù)旦大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清(BSA)的RPMI-1640培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000及TRIzol購自美國Invitrogen公司，SYBR Green PCR試劑盒、miRNA-182、陰性對照(NC)、antimiRNA-NC和anti-miRNA-182購自Ambion公司;侵襲實(shí)驗(yàn)用Boyden小室購自美國Millipore公司;熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司; ZEB2、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2熒光定量PCR Trizol提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)條件: 95℃5 min，95℃10 s，60℃20 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列: miRNA-182上游引物: 5'-TTTGGCAATGGTAGAACTCACACT-3'，下游引物: 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG-3';內(nèi)參照U6上游引物: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。得到的數(shù)據(jù)通過比較Ct值法(2－△△Ct)進(jìn)行定量分析。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞長至70％融合時(shí)可用于轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染36 h后可用于功能實(shí)驗(yàn)。

1.4轉(zhuǎn)移和侵襲能力檢測采用傷口愈合實(shí)驗(yàn)方法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，具體操作方法參見文獻(xiàn)報(bào)道〔4〕。采用Boyden小室分析檢測細(xì)胞侵襲能力，具體步驟:用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)并重懸。將1×105個(gè)細(xì)胞置于小室上層，并補(bǔ)加培養(yǎng)基至300 μl。下層小室中加入含10％胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl。孵育12 h后，未發(fā)生侵襲的細(xì)胞用棉拭子從上層腔室除去。下層小室中的細(xì)胞以0.1％結(jié)晶紫固定染色，計(jì)算出現(xiàn)侵襲的細(xì)胞數(shù)。

1.5生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA-182靶基因通過靶基因預(yù)測軟件聯(lián)合篩選出ZEB2作為miRNA-182的靶基因。

1.6熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證靶基因miRNA靶點(diǎn)預(yù)測軟件提示ZEB2 mRNA的3'端的非翻譯區(qū)(3'UTR)的位點(diǎn)1303～1310 是miRNA-182的可能結(jié)合位點(diǎn)(BS)，體外合成含該位點(diǎn)的DNA片段及含該位點(diǎn)突變體的DNA片段，克隆至雙熒光素酶啟動(dòng)子載體pMIR: pMIR-ZEB2-3'-UTR-wt和pMIR-ZEB2-3'-UTR-mut。將pMIR-ZEB2-3'-UTR-wt或pMIR-ZEB2-3'-UTR-mut 及miRNA-182共同轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.7Western印跡等量提取細(xì)胞蛋白經(jīng)8％～10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸銨凝膠(SDS-PAGE)分離膠和5％濃縮膠分離后，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以含5％ BSA的Tris鹽酸緩沖液(TBST)室溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜孵育。第2天用0.1％ TBST洗膜3次，5 min/次，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。0.1％ TBST洗膜后，硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對條帶進(jìn)行顯色。β-actin作為內(nèi)參對照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1肺癌細(xì)胞和組織標(biāo)本中miRNA-182表達(dá)情況四種具有不同轉(zhuǎn)移能力的肺癌細(xì)胞系miRNA-182表達(dá)高低不同，同轉(zhuǎn)移能力較弱的肺癌細(xì)胞系NL9980(0.36±0.03)或95C(0.19± 0.03)相比，具有高轉(zhuǎn)移能力的肺癌細(xì)胞系95D(0.05±0.02)和L9981(0.04±0.02)其miRNA-182 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)。同時(shí)，與原發(fā)性肺癌組織(0.11±0.06)相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中miRNA-182 mRNA表達(dá)亦顯著下調(diào)(P＜0.05)。

2.2miRNA-182表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系miRNA-182在肺癌組織的表達(dá)水平僅與患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.05)，而與患者年齡、性別、是否吸煙和臨床分期均無明顯關(guān)系(P＞0.05)。見表1。

表1　miRNA-182表達(dá)量與肺癌組織臨床病理特征的關(guān)系

2.3miRNA-182對肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的影響傷口愈合實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組相比，miRNA-182可顯著抑制肺癌細(xì)胞系95D和L9981的轉(zhuǎn)移(P＜0.05) (圖2A)。與對照組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-182可顯著抑制肺癌細(xì)胞系95D和L9981的侵襲能力(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染miRNA-182抑制劑可增加肺癌細(xì)胞系95D 和L9981的侵襲能力(P＜0.05) (圖2B)。

圖1　miRNA-182對肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的影響

2.4miRNA-182靶基因預(yù)測通過靶基因預(yù)測軟件尋找miRNA-182可能作用的靶基因，結(jié)果提示ZEB2可能為miRNA-182的功能性靶基因，且為感興趣的基因。miRNA-182預(yù)測結(jié)合的ZEB2 3'-UTR的靶位點(diǎn)見圖2。為確定miRNA-182是否和ZEB2間存在直接的相互作用，構(gòu)建了含野生型和突變型ZEB2 的3'-UTR序列的pMIR載體。結(jié)果顯示，與對照組(1.01± 0.13)相比，共轉(zhuǎn)染野生型pMIR-ZEB2 3'-UTR載體和miRNA-182，熒光素酶活性(0.57±0.04)顯著降低(P＜0.05) ;與對照組(1.02±0.2)相比，共轉(zhuǎn)染突變型pMIR-ZEB2 3'-UTR載體和miRNA-182的熒光素酶活性(1.12±0.16)未出現(xiàn)顯著性改變(P＞0.05)。

圖2　miRNA-182靶基因預(yù)測及驗(yàn)證

2.5miRNA-182對肺癌細(xì)胞ZEB2表達(dá)的影響miRNA-182 miRNA-182可顯著抑制肺癌細(xì)胞系95D和L9981中ZEB2的表達(dá)，上調(diào)與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)E-cadherin表達(dá)，并下調(diào)EMT相關(guān)Vimentin的表達(dá)。見圖3。

圖3　Western印跡檢測miRNA-182對肺癌細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3　討論

miRNA是一類小的，非編碼RNAs，長度約為19～25個(gè)核苷酸。近年來，許多研究表明miRNA在人類癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。然而關(guān)于miRNA-182在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)機(jī)制尚未研究清楚。關(guān)于miRNA-182在惡性腫瘤中表達(dá)及作用的文獻(xiàn)報(bào)道還很少，且存在矛盾之處。Moskwa等〔5〕的研究證實(shí)，在惡性度較高的乳腺癌細(xì)胞中miRNA-182的表達(dá)顯著低于惡性度較低的乳腺癌細(xì)胞;結(jié)果與Patryk等的研究結(jié)果基本一致。其他文獻(xiàn)報(bào)道〔6〕，高表達(dá)miRNA-182的ER+乳腺癌患者，其對內(nèi)分泌治療敏感，無復(fù)發(fā)，生存期長，且miRNA-182與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。然而也有文獻(xiàn)報(bào)道〔7～9〕，在結(jié)直腸癌、前列腺癌、卵巢癌等癌組織中miRNA-182表達(dá)顯著上調(diào)。這可能是由于miRNA-182在不同的腫瘤組織中其調(diào)控的靶基因不盡相同，而其下游靶基因的生物學(xué)效應(yīng)決定了miRNA-182的作用〔10〕。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)樣本的選取和實(shí)驗(yàn)方法的不同也可能會(huì)造成結(jié)果的不一致。

正因?yàn)閙iRNAs下游靶基因的生物學(xué)效應(yīng)決定了miRNAs的作用。本研究通過靶基因預(yù)測軟件聯(lián)合篩選出miRNA-182的靶基因，在眾多靶基因中，因ZEB2在人類癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，而成為我們感興趣的靶基因。ZEB2已證實(shí)在多種癌癥的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，如胃癌，卵巢癌，鱗狀細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌〔11〕。在EMT過程中，ZEB2通過結(jié)合于E-鈣黏蛋白啟動(dòng)子區(qū)的CACCT(G)基序而特異性地抑制E-鈣粘蛋白的表達(dá)〔12〕。本研究結(jié)果提示miRNA-182可能是通過調(diào)節(jié)ZEB2的表達(dá)而抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。EMT過程是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶穿透基底膜而轉(zhuǎn)移至血液循環(huán)，這一過程包括了上皮特異性E-鈣黏蛋白和間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白的重新分布。

綜上，miRNA-182可能是一類新的腫瘤抑制miRNA。miRNA-182可通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)ZEB2而抑制肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲，為肺癌的發(fā)生發(fā)展提供了一種新的見解。此外，在肺癌治療中，miRNA-182可作為一種潛在的治療靶點(diǎn)。

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〔2015-03-19修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:朱佳龍(1968-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事心胸外科相關(guān)疾病。

〔中圖分類號(hào)〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 15-4182-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.032