李 菡，姜寶珍，劉澤玉，陳 偉，崔正森，楊 青，武前枝，倪琛琛，張志紅

HMGB1／TLRs信號(hào)通路在大鼠機(jī)械通氣肺損傷中的作用

李 菡，姜寶珍，劉澤玉，陳 偉，崔正森，楊 青，武前枝，倪琛琛，張志紅

摘要目的 探討高遷移率族蛋白B1（HMGB1）／Toll樣受體（TLRs）信號(hào)通路在大鼠機(jī)械通氣肺損傷（VILI）中的作用機(jī)制。方法 32只健康SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（N組）不行機(jī)械通氣，保留自主呼吸；高氧流量組（HN組）氧流量7 L／min；小潮氣量機(jī)械通氣組（LV組）潮氣量7 ml／kg；大潮氣量機(jī)械通氣組（HV組）潮氣量30 ml／kg。通氣4 h后處死動(dòng)物取肺組織，HE染色觀察各組肺組織損傷情況，檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)、肺濕重干重比值（W／D）；ELISA法檢測(cè)BALF中IL-6、TNF-α、HMGB1水平；Western blot法檢測(cè)肺組織HMGB1、TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)。應(yīng)用單因素方差分析及兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)進(jìn)行不同組間的比較。結(jié)果 與N組相比，HV組及HN組大鼠肺W／D，BALF中WBC計(jì)數(shù)，BALF中HMGB1、TNF-α、IL-6水平以及HMGB1、TLR2、TLR4蛋白表達(dá)均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LV組上述各指標(biāo)與N組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 大潮氣量機(jī)械通氣及高氧流量通氣均可引起大鼠肺組織急性炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與HMGB1／TLRs信號(hào)通路激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞機(jī)械通氣；急性肺損傷；高遷移率族蛋白B1；Toll樣受體

2015－03－17接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年呼吸內(nèi)科，安徽醫(yī)科大學(xué)呼吸病研究所，合肥 230022

機(jī)械通氣廣泛應(yīng)用于臨床上各種危急重癥患者的救治，對(duì)急性呼吸窘迫綜合征患者的治療有重要意義。然而，機(jī)械通氣亦可作為一種損傷因素誘發(fā)或加重肺損傷，即機(jī)械通氣肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）［1］。目前公認(rèn)機(jī)械通氣所引起的“二次打擊”能夠促進(jìn)肺組織炎性進(jìn)程，從而導(dǎo)致肺損傷［2］。VILI的可能機(jī)制是機(jī)械通氣時(shí)由于機(jī)械牽張的作用，導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等細(xì)胞因子釋放［3］。高遷移率族蛋白B1（high-mobility group box protein 1，HMGB1）是一種極強(qiáng)的炎性介質(zhì)［4］。氣管內(nèi)給予HMGB1可誘發(fā)急性肺損傷［5］。動(dòng)物試驗(yàn)和臨床實(shí)踐證實(shí)，機(jī)械通氣時(shí)，機(jī)體HMGB1的表達(dá)水平升高，阻斷HMGB1可以顯著降低肺炎癥反應(yīng)［6］。該實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究HMGB1／Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號(hào)通路的變化及其對(duì)炎癥因子的影響，探討HMGB1／TLRs信號(hào)通路在大鼠不同潮氣量機(jī)械通氣及單純高氧濃度通氣肺損傷中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD成年雄性大鼠32只，200～250 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成4組：大潮氣量機(jī)械通氣組（HV組）、小潮氣量機(jī)

械通氣組（LV組）、高氧流量組（HN組）和正常對(duì)照組（N組）。各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1．2 主要儀器與試劑 小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟公司）；光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；瑞氏染色試劑盒（南京建成科技有限公司）；ELISA試劑盒（美國R＆D公司）；HMGB1抗體試劑盒、TLR2／TLR4抗體（美國Cell Signaling公司）。

1．3 大鼠VILI模型制備 用10%水合氯醛（0.3 ml／kg）腹腔注射麻醉，每30 min追加首劑的1／3，頸部皮膚消毒后行氣管切開插管固定，并維持大鼠體溫約37℃。LV組、HV組均連接小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣并吸入室內(nèi)空氣；N組保留大鼠自主呼吸室內(nèi)空氣，單籠飼養(yǎng)；HN組給予高濃度吸氧7 L／min，無機(jī)械通氣，單籠飼養(yǎng)。LV、HV組潮氣量分別為7、30 ml／kg，通氣時(shí)間4 h，吸氣與呼氣比為1∶2，并根據(jù)經(jīng)皮氧飽和度及時(shí)調(diào)整呼吸頻率；HN組吸氧流量為7 L／min，吸氧濃度約為50%，吸氧時(shí)間4 h。通氣結(jié)束后腹主動(dòng)脈取血處死。

1．4 各組肺組織肺濕重干重比值（lung ratio of wet weight dry weight，W／D）及支氣管肺泡灌洗液（bronchial lavage fluid，BALF）中白細(xì)胞（white blood cells，WBC）計(jì)數(shù) 術(shù)后，結(jié)扎大鼠右肺主支氣管，對(duì)大鼠左肺行支氣管肺泡灌洗；4℃生理鹽水緩慢灌洗，每次2ml，緩慢回抽BALF，重復(fù)3次，回收率＞80%；BALF以單層紗布過濾，再將BALF經(jīng)2 000 r／min離心10 min，取上清夜置-20℃，分裝保待測(cè)；沉渣重新懸浮涂片后，光鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行WBC計(jì)數(shù)。

1．5 BALF中IL-6、TNF-α和HMGB1水平的測(cè)定 采用ELISA法檢測(cè)BALF中IL-6、TNF-α、HMGB1的含量。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1．6 各組肺組織HMGB1、TLR2、TLR4表達(dá)含量的變化 術(shù)后，結(jié)扎大鼠右肺主支氣管，取右肺中葉分裝置于－80℃冰箱中冷藏待測(cè)。采用Western blot法檢測(cè)各組肺組織中HMGB1、TLR2、TLR4表達(dá)含量的變化。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示；經(jīng)檢驗(yàn)計(jì)量資料均符合正態(tài)分布及方差齊性，多組比較采用單因素方差分析和兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 肺組織病理學(xué)改變 N組為正常肺組織；HN組可見肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚；LV組未見明顯的病理學(xué)改變；HV組可見有炎癥損傷，包括肺泡壁增厚、間質(zhì)滲出和中性粒細(xì)胞浸潤等。見圖1。

2．2 各組肺組織W／D及BALF中WBC計(jì)數(shù)的比較 4組肺組織W／D的方差分析比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝165.255，P＝0.001），BALF中WBC計(jì)數(shù)的方差分析比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝186.982，P＝0.001）。與N組比較，HN組及HV組肺組織W／D明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝10.737，P＝0.001；t＝38.575，P＝0.001），而LV組肺組織W／D與N組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在BALF中，HN組及HV組WBC數(shù)量與N組相比均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝10.479，P＝0.001；t＝18.662，P＝0.001），而LV組WBC變化與N組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

2．3 各組BALF中IL-6、TNF-α、HMGB1的變化機(jī)械通氣4 h后，4組BALF中IL-6水平的方差分析比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝5.530，P＝0.003）；4 組BALF中TNF-α水平的方差分析比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝3.772，P＝0.017）；4組BALF中HMGB1水平的方差分析比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F ＝115.379，P＝0.001）。與N組相比，HV組BALF 中IL-6、TNF-α、HMGB1水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.049，P＝0.006；t＝3.028，P＝0.006；t＝24.816，P＝0.001）；HN組BALF中IL-6、TNF-α、HMGB1水平也均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.211，P＝0.004；t＝2.082，P＝0.048；t＝

10.216，P＝0.001）；而LV組BALF中IL-6、TNF-α、HMGB1水平升高不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

2．4 各組肺組織HMGB1、TLR2、TLR4蛋白含量的變化 Western blot法檢測(cè)4組肺組織中HMGB1、TLR2、TLR4表達(dá)情況。4組肺組織HMGB1表達(dá)水平的方差分析差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝204.008，P＝0.001）；4組肺組織TLR2表達(dá)水平的方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝5.207，P＝0.028）；TLR4表達(dá)水平的方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝9.113，P＝0.006）。與N組比較，HV組HMGB1、TLR2、TLR4表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝27.161，P＝0.01；t＝849.864，P＝0.045；t＝556.882，P＝0.001）；HN組TLR2、TLR4表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝943.826，P ＝0.030；t＝265.758，P＝0.031），LV組HMGB1、TLR2、TLR4表達(dá)水平與N組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4～6。

3 討論

研究［1］表明，不適當(dāng)?shù)臋C(jī)械通氣所造成的氣壓傷、容量傷和肺不張損傷等機(jī)械損傷，最后的共同途徑是誘發(fā)炎性細(xì)胞和炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)，即肺生物學(xué)損傷。

TNF-α被稱為炎癥啟動(dòng)因子，能致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，使血管通透性增加。IL-6是重要的炎癥趨化因子，能促使中性粒細(xì)胞滲出至炎癥部位，促使炎癥反應(yīng)的發(fā)生。HMGB1可分布于細(xì)胞膜上，能夠與多種細(xì)胞膜受體結(jié)合［7］。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了4組大鼠BALF中IL-6、TNF-α和HMGB1水平的變化。結(jié)果

顯示與N組相比，HV組和HN組BALF中，IL-6、TNF-α和HMGB1水平，均是明顯升高的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而LV組BALF中上述各指標(biāo)水平與N組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果說明了大鼠在大潮氣量機(jī)械通氣及高氧流量通氣時(shí)產(chǎn)生了明顯的急性炎癥反應(yīng)，隨著潮氣量及氧流量的增加，炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重。

TLR是近年發(fā)現(xiàn)的一類新的細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)跨膜受體，TLR4在肺部主要表達(dá)于單核-巨噬細(xì)胞，能識(shí)別內(nèi)源性及外源性炎癥因子并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［7］。TLR2能識(shí)別病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式兩類物質(zhì)而啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)通路，在核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，導(dǎo)致多種炎癥因子基因如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α等表達(dá)上調(diào)，引起炎癥反應(yīng)，因此TLRs被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)瀑鏈的“閘門”［8］。本研究顯示，HV組肺組織HMGB1蛋白表達(dá)水平與N組相比顯著上調(diào)，LV組和HN組HMGB1蛋白表達(dá)水平較N組有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示大鼠在大潮氣量機(jī)械通氣后隨著機(jī)械通氣時(shí)肺泡的過度擴(kuò)張或反復(fù)開放產(chǎn)生的剪切力以及局部肺的萎陷，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的變形和細(xì)胞漿膜的破壞，導(dǎo)致HMGB1主動(dòng)分泌或被動(dòng)釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。這與本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)HV組及HN組BALF中HMGB1的水平顯著升高相一致；說明HMGB1在大鼠大潮氣量機(jī)械通氣及高氧流量通氣所致肺損傷中起了促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示HV組和HN組肺組織TLR4、TLR2含量表達(dá)水平與N組相比顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LV組肺組織TLR2、TLR4含量表達(dá)較N組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；該結(jié)果與各組肺組織中HMGB1蛋白表達(dá)水平趨勢(shì)基本一致。同時(shí)HMGB1作為TLRs的內(nèi)源性配體［9］，受TLR和高級(jí)糖基化末端產(chǎn)物受體耦合的信號(hào)通路的激活所調(diào)控。TLR2和TLR4能夠引發(fā)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)流，包括p38 MAPK、c-Jun氨基端激酶和核受體的激活。這些信號(hào)通路的激活最終導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的釋放，如TNF-α、IL-1β［10］。隨著HMGB1／TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，誘導(dǎo)TNF-α、IL-6等炎癥因子表達(dá)上調(diào)，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管通透性增加，屏障破壞，肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)大量中性粒細(xì)胞聚集，肺間質(zhì)水腫，透明膜形成；W／D增加；本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)隨著潮氣量增加，大鼠BALF中WBC及炎癥因子IL-6、TNF-α及HMGB1的水平明顯升高，而IL-6、TNF-α的升高進(jìn)

一步促使炎癥細(xì)胞向肺泡內(nèi)浸潤，造成更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，引起肺損傷。

綜上所述，HMGB1／TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可能在大鼠大潮氣量機(jī)械通氣及高氧流量通氣肺損傷中起促進(jìn)作用。

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HMGB1／TLRs signaling pathway may play a key role in ventilator induced lung injury on rats

Li Han，Jiang Baozhen，Liu Zeyu，et al
（Dept of Pulmonary，The Geriatric Institute，The Eldery Respiratory Medicine of The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective The aim of this experiment was to investigate the role of high-mobility group box protein 1 （HMGB1）／Toll-like receptors（TLRs）signaling pathway in mechanical ventilation lung injury．Methods 32 healthy male SD rats were randomly divided into the following 4 groups according to tidal volume and the concentration of inhaled oxygen：room air inhalation without mechanical ventilation（N）；high concentration of oxygen inhalation（50%）without mechanical ventilation（HN）；low tidal volume ventilation with room air inhalation（LV）（7 ml／kg）；high tidal volume ventilation with room air inhalation（HV）（30 ml／kg）．The ventilation lasted for four hours．Then WBC in BALF and the lung W／D were detected．The adapted ELISA was used to determine the concentrations of HMGB1，tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-6（IL-6）in BALF from rat．The histological changes of lung tissue were observed by HE staining．The expressions of HMGB1，TLR4 and TLR2 in lung tissue of all rats were detected by western blot．Results HMGB1，TLR2 and TLR4 expressions，the concentrations of HMGB1，TNF-α and IL-6 in BALF，the WBC in BALF and the lung W／D were significantly higher in HV group and HN group（P＜0.05）．While they were no significant differences in LV group．Conclusion These findings demonstrated that high tidal volume ventilation and high concentration of oxygen inhalation could aggravate lung injury in rats through HMGB1／TLRs signaling pathway．

Key wordsmechanical ventilation；acute lung injury；high-mobility group box protein 1；Toll-like receptors

作者簡介：李 菡，女，碩士研究生；張志紅，女，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhangzhihope＠126．com

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1208085MH167）；安徽省學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人選基金（編號(hào)：皖人社秘［2013］228號(hào)）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）04－0458－05

中圖分類號(hào)R 563．9