齊清華， 陳宇熹， 葉　舟

(福建農(nóng)林大學植物保護學院， 福建 福州 350002)

雙水相法分離螺旋藻藻藍蛋白與多糖

齊清華， 陳宇熹， 葉舟*

(福建農(nóng)林大學植物保護學院， 福建 福州 350002)

摘要:以螺旋藻為原料，采用PEG2000-硫酸鎂雙水相體系對螺旋藻粗提液中的藻藍蛋白和多糖進行分離。分別探討了PEG2000質(zhì)量分數(shù)、硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)、離子強度、體系pH及萃取次數(shù)對雙水相體系萃取藻藍蛋白與多糖的影響，設(shè)計正交試驗優(yōu)化萃取條件，并考察了螺旋藻的反萃取體系條件。結(jié)果表明：當硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)為14%，PEG質(zhì)量分數(shù)為6%，KCl質(zhì)量分數(shù)為0.5%，體系為pH4.0時，為優(yōu)化雙水相萃取體系。螺旋藻水提液通過雙水相萃取，藻藍蛋白富集于上相，萃取率為93.91%；下相中糖類萃取率為59.58%。收集上相，采用12%PEG，6%硫酸鎂的雙水相體系對藻藍蛋白進行反萃取，藻藍蛋白反萃取率為99.06%。螺旋藻水提液經(jīng)過PEG2000-硫酸鎂雙水相體系萃取與反萃取，藻藍蛋白回收率達92.66%，藻藍蛋白純度由0.78提高到2.64。

關(guān)鍵詞:雙水相萃?。?藻藍蛋白； 多糖

螺旋藻具有很高的營養(yǎng)價值，含有高達50%-75%的蛋白質(zhì)，多種維生素，必需氨基酸，必需脂肪酸和礦物質(zhì)等；此外，螺旋藻中還含有多糖(polysaccharides of spirulina platensis， PSP)、藻藍蛋白(C-phycocyanin , CPC)、γ-亞麻酸等生理活性物質(zhì)，因此越來越多地被開發(fā)為功能性食品、保健品等(Belayetal.， 1993； Capellietal.， 2010； 張鵬， 2011； 張文， 2013)。在眾多活性物質(zhì)中，熱點研究的對象為多糖與藻藍蛋白。螺旋藻多糖是一類具有天然生物活性的物質(zhì)，具有增強免疫力、抗氧化、抗輻射、抗腫瘤和降血糖等功能(韋金河， 2009； 陳雷， 2011； 徐小娟， 2012； Paragesetal.， 2012； Chaiklahanetal.， 2013)。藻藍蛋白是一種光合色素，其水溶液為亮藍色，可作為天然色素應(yīng)用于食品、化妝品等工業(yè)，高純度藻藍蛋白可被開發(fā)為熒光劑，應(yīng)用于生物學、化學和細胞學等，具有更高的經(jīng)濟價值。此外，藻藍蛋白還具有諸多生理活性功能，如提高免疫力、抗癌、抗氧化等功能(張成武， 1996； 李冰， 2009； 孫國艷， 2010)。

雙水相萃取技術(shù)具有條件溫和、易于放大和控制等優(yōu)點，適用于生物物質(zhì)的分離和純化。Patiletal.(2007)研究了聚乙二醇分子量、聚乙二醇與鹽的質(zhì)量分數(shù)、pH值等對雙水相體系萃取藻藍蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)與兩種聚合物形成的雙水相體系相比，聚合物-鹽雙水相體系效果更好。本文探討采用雙水相萃取方法分離螺旋藻中多糖與藻藍蛋白，并對藻藍蛋白進行了純化。

1材料與方法

1.1材料與試劑

螺旋藻干粉(鮮藻由福建省神六保健食品有限公司提供，冷凍真空干燥處理后于-20 ℃避光保存)；聚乙二醇2000，硫酸鎂，氯化鈉，氯化鉀等試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

CF15RXⅡ型離心機(日本HITACHI公司)，UV-1801紫外/可見光分光光度計(北京瑞利分析儀器有限公司)，pH計，漩渦振蕩器。

1.3實驗方法

1.3.1螺旋藻水提液的制備稱取1 g藻粉，加入100 mL水溶脹后4次反復凍融破壁(-20 ℃冷凍，室溫融化)，5000 r/min(4℃)離心15 min，取上清液定容至100 mL得螺旋藻水提液，測得藻藍蛋白純度(A620/A280)為0.78，貯存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2PEG2000-硫酸鎂雙水相圖的制作 取三支試管，分別稱取0.500 g PEG2000于試管中，加入0.5 mL去離子水，用膠頭滴管緩慢滴加質(zhì)量分數(shù)為23%的硫酸鎂溶液，邊滴加邊搖勻，直到溶液開始出現(xiàn)渾濁為止，記錄此時的溶液質(zhì)量，計算PEG2000和硫酸鎂的在體系中質(zhì)量分數(shù)；然后再添加0.5 mL去離子水，重復以上步驟，記錄和計算數(shù)據(jù)，取三管平均值。以PEG2000質(zhì)量分數(shù)(%)為縱坐標，硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)(%)為橫坐標繪制曲線。

1.3.3雙水相體系的配制取15 mL離心管，稱不同質(zhì)量分數(shù)的PEG2000、硫酸鎂、中性鹽，加入2 mL螺旋藻水提液，加水至總質(zhì)量為10 g，充分混勻后靜置3 h分相。

1.3.4計算方法藻藍蛋白在620 nm處有特征吸收峰，蛋白質(zhì)在280 nm處有特征吸收峰，因此藻藍蛋白的純度用A620/A280表示(Bennettetal.，2007)。藻藍蛋白濃度(CCPC)、相比(R)、分配系數(shù)(P)計算公式如下：

式中：A280、A620、A650分別為樣品液在波長280nm、620nm、650nm處吸光度值。

多糖濃度測定采用苯酚硫酸法，以葡萄糖為標準品，標準曲線為A=0.0130C+0.0117(R2=0.9997)，其中C為多糖濃度(μg/ml), A為490nm處吸光度值。

2結(jié)果與分析

2.1PEG2000-硫酸鎂雙水相圖

PEG2000-硫酸鎂雙水相相圖見圖1，根據(jù)雙節(jié)線圖選擇合適的PEG與硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)范圍進行探討。

圖1　PEG2000-硫酸鎂雙水相相圖

2.2PEG2000質(zhì)量分數(shù)對雙水相體系的影響

當硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)為15%時，梯度調(diào)節(jié)PEG2000質(zhì)量分數(shù)。結(jié)果表明，當硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)為15%， PEG質(zhì)量分數(shù)為5%-15%時，體系分相完全；當PEG質(zhì)量分數(shù)為20%時，藻藍蛋白在PEG相中發(fā)生了嚴重沉降；當PEG質(zhì)量分數(shù)達到25%時不能分相；因此選擇6%-18%質(zhì)量分數(shù)的PEG質(zhì)量分數(shù)進一步探討，結(jié)果見表1。

當硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)一定時，在一定范圍內(nèi)隨著PEG質(zhì)量分數(shù)的增加，相比逐漸升高，藻藍蛋白的分配系數(shù)先降低后升高，多糖分配系數(shù)逐漸降低，藻藍蛋白的純度呈降低趨勢，上相中藻藍蛋白的萃取率逐漸增加，下相中多糖的萃取率先降低后升高。

表1　PEG2000質(zhì)量分數(shù)對多糖及藻藍蛋白萃取的影響

2.3硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)對雙水相體系的影響

當PEG2000質(zhì)量分數(shù)為10%時，調(diào)節(jié)硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)，考察對雙水相形成及藻藍蛋白萃取的影響。當PEG2000質(zhì)量分數(shù)為10%，硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)為10%-20%時，體系能夠分相完全；當硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)增加到25%時，硫酸鎂不能完全溶解，因此選擇10%-20%質(zhì)量分數(shù)的硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)進一步探討。

由表2可以得出，當PEG質(zhì)量分數(shù)一定時，隨著硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)的增加，相比逐漸降低，藻藍蛋白的分配系數(shù)、藻藍蛋白的純度以及上相中藻藍蛋白的萃取率和下相中多糖的萃取率都呈先升高后降低趨勢。當PEG質(zhì)量分數(shù)為10%，硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)為16%時，上相中藻藍蛋白純度、得率以及下相中多糖萃取率都達到最大。

表2　硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)對藻藍蛋白萃取的影響

2.4離子強度對雙水相體系的影響

雙水相體系的上下相間存在電位差，通過加入不同種類和濃度的鹽可以使體系的電荷狀態(tài)和疏水作用發(fā)生改變，進而對物質(zhì)在兩相中的分配產(chǎn)生影響(Patiletal.， 2007)。配制PEG2000質(zhì)量分數(shù)10%、硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)16%的體系，考察不同濃度NaCl和KCl兩種鹽對藻藍蛋白萃取的影響，結(jié)果見表3。

由表3可知，隨著NaCl和KCl濃度的升高，上相中藻藍蛋白純度與萃取率都先升高后降低；比較兩種鹽發(fā)現(xiàn)添加KCl效果更佳。當PEG2000質(zhì)量分數(shù)10%、硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)16%時，與未添加KCl的體系相比，添加質(zhì)量分數(shù)為1.0%的KCl情況下，上相中藻藍蛋白純度與萃取率都較高，但是當KCl質(zhì)量分數(shù)為大于2.0%時，藻藍蛋白的純度與萃取率反而降低。因此選擇KCl質(zhì)量分數(shù)為0，0.5%，1.0%，1.5%進一步研究。

表3　離子強度對藻藍蛋白萃取的影響

2.5pH值對雙水相體系的影響

雙水相體系pH值變化能改變兩相的電位，并影響蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)，從而影響蛋白在兩相中的分配(鄭楠， 2006)。配制硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)為16%，PEG質(zhì)量分數(shù)為10%的雙水相體系，體系初始pH為4.2-4.3。由于藻藍蛋白較穩(wěn)定的pH范圍為4.5-8.5(張以芳， 1999)，因此調(diào)節(jié)體系pH分別為4.0，5.0，6.0，7.0和8.0，考察pH對藻藍蛋白在雙水相體系中的影響，結(jié)果見圖2。

圖2表明，隨著雙水相體系pH的升高，上相中藻藍蛋白的純度與萃取率都呈降低趨勢。而體系初始pH約4.3，因此在后面的研究中不對體系pH進行調(diào)節(jié)。

圖2　pH值對雙水相萃取藻藍蛋白的影響

2.6正交試驗

綜合單因素實驗結(jié)果，設(shè)計L16(34)正交試驗考察硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)、PEG2000質(zhì)量分數(shù)以及KCl質(zhì)量分數(shù)對雙水相萃取多糖與藻藍蛋白的影響，結(jié)果與分析見表4與表5。

綜合考慮上相中藻藍蛋白純度與萃取率，下相中多糖萃取率，硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)14%，PEG2000質(zhì)量分數(shù)為6%，KCl質(zhì)量分數(shù)為0.5%時為優(yōu)化體系。螺旋藻水提液通過此雙水相體系萃取，下相中多糖萃取率為59.58%，藻藍蛋白富集于上相，萃取率為93.91%，藻藍蛋白純度由0.78提高到1.95。

2.7雙水相萃取與反萃取藻藍蛋白

雙水相萃取與反萃取藻藍蛋白螺旋藻水提液經(jīng)PEG2000-硫酸鎂雙水相優(yōu)化體系萃取后收集上相，加入適量硫酸鎂與水反萃取藻藍蛋白。結(jié)果表明，藻藍蛋白的較佳反萃取體系為PEG質(zhì)量分數(shù)12%，硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)6%，藻藍蛋白反萃取率為99.06%。螺旋藻水提液經(jīng)過PEG2000-硫酸鎂雙水相體系萃取與反萃取，藻藍蛋白回收率達92.66%，藻藍蛋白純度由1.95提高到2.64。

表4　雙水相萃取正交試驗結(jié)果

注：A為硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)，B為PEG2000質(zhì)量分數(shù)，C為KCl質(zhì)量分數(shù)

表5　雙水相萃取正交試驗結(jié)果分析

注：表中k1、k2、k3表示各因素不同水平下CPC純度、CPC萃取率或多糖萃取率的平均值，R表示極差分析；其中A為硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)，B為PEG2000質(zhì)量分數(shù)，C為KCl質(zhì)量分數(shù)

3討論

本研究分別考察了PEG2000質(zhì)量分數(shù)、硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)、離子強度和體系pH值在PEG-硫酸鎂雙水相體系中對螺旋藻藻藍蛋白和多糖萃取的影響，體系中上相為PEG相，下相為鹽相。當硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)一定時，隨著PEG質(zhì)量分數(shù)在一定范圍內(nèi)的增加，有利于藻藍蛋白在上相中富集，多糖更多存在于下相中；但是隨著PEG質(zhì)量分數(shù)進一步增大，可能更多的雜蛋白進入上相，使上相中藻藍蛋白的純度降低。當PEG質(zhì)量分數(shù)一定時，隨著硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)在一定范圍內(nèi)的提高，雙水相體系逐漸遠離臨界點，物質(zhì)在兩相中界面張力增大，有利于藻藍蛋白在上相富集，多糖在下相富集；當硫酸鎂質(zhì)量分數(shù)更大時，上相體積逐漸減小，同時粘度逐漸增大，不利于藻藍蛋白在上相的富集。綜合雙水相萃取單因素試驗和正交試驗結(jié)果，藻藍蛋白萃取率達到93.91%；多糖萃取率為59.58%。

雙水相體系分相后，藻藍蛋白富集于PEG相中，同時體系中少量硫酸鎂、PEG會分別存在于PEG相和硫酸鎂相中，因此需要在萃取試驗的基礎(chǔ)上進行反萃取，使藻藍蛋白進入下相，以利于藻藍蛋白的后續(xù)回收利用。通過反萃取試驗，大大提高了藻藍蛋白的純度，純度由0.78提高到2.64。雙水相萃取條件溫和，工藝簡便，易擴大，適合于工業(yè)應(yīng)用，本試驗為進一步研究螺旋藻藻藍蛋白和多糖的雙水相萃取工藝條件具有一定的指導意義。

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(責任編輯：陳曉雯)

齊清華，陳宇熹，葉舟.2015.雙水相法分離螺旋藻藻藍蛋白與多糖.武夷科學，31：154-160.

The extraction of C-phycocyanin and polysaccharides fromSpirulina

using aqueous two-phase system

Qing-Hua QI, Yu-Xi CHEN, Zhou YE*

(CollegeofPlantProtection,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

Abstract:PEG2000-MgSO4aqueous two-phase extraction (ATPE) was used to isolate C-phycocyanin and polysaccharides from crude extract of Spirulina. The influence of various process parameters on the isolation and purification of C-phycocyanin and polysaccharides was studied, such as mass fraction of PEG2000, magnesium sulfate, neutral salts and system pH, and the orthogonal experiment was designed to optimize conditions. The reverse extraction of phycocyanin was also studied. The results showed that the optimal ATPE conditions were 14% MgSO4, 6% PEG2000, 0.5% KCl, system pH 4.0. After the optimal ATPE, the yield of CPC was 93.91% from the top phase, and saccharides yield were 59.58% from the bottom phase. The optimal reverse extraction condition of CPC was 12% PEG2000, 6% MgSO4. After extraction and reverse extraction, 92.66% of CPC was obtained. Meanwhile, the purity of CPC was increased to 2.64 from initial 0.78.

Key words:aqueous two-phase extraction (ATPE); polysaccharide; phycocyanin

中圖分類號:Q946

文獻標識碼:A

文章編號：1001-4276-(2015)01-0154-07

作者簡介:齊清華(1989-)，女，碩士研究生。研究方向：天然藥物。Email：542220350@qq.com。*通信作者葉舟( 1957-)，男，教授。研究方向：天然藥物。Email: yezhou1182@126.com。

基金項目:福建省高校產(chǎn)學合作科技重大項目(2013N5001)、福建省自然科學 (2011J01077)資助。

收稿日期：2015-03-03; 發(fā)表日期：2015-10-31