葉 巍，薛應(yīng)鈺，徐秉良，陳 龍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

長(zhǎng)枝木霉對(duì)白三葉種子發(fā)芽及幼苗抗逆性研究

葉 巍，薛應(yīng)鈺，徐秉良，陳 龍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

在室內(nèi)條件下，用不同濃度的長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液對(duì)白三葉種子進(jìn)行處理，研究了其種子發(fā)芽率、根芽長(zhǎng)及抗逆性酶活變化，以及長(zhǎng)枝木霉對(duì)白三葉種子的促生作用及抗逆性的影響。結(jié)果表明，長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液濃度在5.0×105個(gè)/mL～1.0×107個(gè)/mL時(shí)能促進(jìn)白三葉種子活性，在孢子濃度為1.0×106個(gè)/mL時(shí)，發(fā)芽率為93%，與對(duì)照80%相比提高了16.25%；胚根長(zhǎng)1.93 cm，與對(duì)照1.26 cm相比增長(zhǎng)了53.1%；胚芽長(zhǎng)1.33 cm，與對(duì)照1.04 cm相比增長(zhǎng)了27.8%。抗逆性結(jié)果表明，長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液能夠提高白三葉種子抗病害及不良環(huán)境的能力，降低MDA含量，提高PAL、POD的活性。其中，孢子懸浮液濃度為5.0×105個(gè)/mL時(shí)，PAL活性最高，為2.157 U/(g·min) FW；孢子濃度為1.0×106個(gè)/mL時(shí)POD的活性最高，為29.875 U/g FW；孢子懸浮液濃度5.0×105個(gè)/mL時(shí)，MDA含量最低，為1.012 μmol/g FW。

木霉菌；孢子懸浮液；白三葉；促生作用；抗逆性

白三葉(Trifoliumrepens)作為一種多年生草本豆科植物分布于世界各地，其含有黃酮類、氨基酸、糖類和維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分[1]，并且白三葉對(duì)銅、鉛、鎘等重金屬有富集作用，可為土壤重金屬污染的修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)[2，3]。白三葉對(duì)土壤要求不嚴(yán)，并且由于其具有抗逆性強(qiáng)、蛋白含量高、耐寒、抗旱、管理費(fèi)用低、株型低矮等優(yōu)點(diǎn)被廣泛種植[4，5]。雖然白三葉具有多種價(jià)值，但隨著白三葉的大面積種植，其病蟲害的危害日趨嚴(yán)重[6]。因此，如何提高白三葉的抗性成為生產(chǎn)上亟待解決的問(wèn)題之一。

木霉菌(Trichodermaspp.)屬半知菌類的絲孢綱(Hyphomycetes)，廣泛存在于森林腐殖質(zhì)層和農(nóng)田果園等的土壤中[7]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，木霉菌至少對(duì)18屬29種植物病原真菌有拮抗作用，由于其具有廣譜性、適應(yīng)性強(qiáng)和多機(jī)制的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[8]。木霉菌不僅對(duì)病原微生物有拮抗作用，而且能直接作用于植物促進(jìn)其萌發(fā)生長(zhǎng)和開(kāi)花，且其本身受外界干擾影響小，因此在植病生防中具有重要的、不可忽視的作用[9]。

已有研究報(bào)道了木霉屬菌株可以促進(jìn)植物種子萌發(fā)、植株的生長(zhǎng)和開(kāi)花、提高作物產(chǎn)量等[10]。焦琮等[11]發(fā)現(xiàn)康氏木霉(T.koningii)活孢可提高棉花和菜豆種子活力[11]，梁志懷等[12]用哈茨木霉(T.harziznum)發(fā)酵液對(duì)豇豆種子處理后對(duì)其幼苗具有促進(jìn)作用。程玲娟等[13]用深綠木霉(T.viride)對(duì)牧草草種進(jìn)行處理，證明深綠木霉對(duì)牧草草種的發(fā)芽有明顯促生作用。張樹(shù)武等[14]研究發(fā)現(xiàn)，不同稀釋倍數(shù)深綠木霉發(fā)酵液對(duì)白三葉的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、POD、PPO等有明顯的影響[14]。目前，對(duì)促生作用研究較多的木霉是哈茨木霉和深綠木霉，而長(zhǎng)枝木霉是我國(guó)新鑒定的木霉菌種，有關(guān)其促生作用和抗逆性研究與利用報(bào)道較少。

試驗(yàn)通過(guò)研究不同濃度長(zhǎng)枝木霉的孢子懸浮液對(duì)白三葉種子的促生效果以及誘導(dǎo)植物抗逆性的影響，為長(zhǎng)枝木霉菌劑的開(kāi)發(fā)提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試長(zhǎng)枝木霉(T.longibrachiatum)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院植物病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；供試的海發(fā)白三葉由蘭州步畝園林公司提供；使用PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂12 g，加水定容至1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木霉菌的孢子懸浮液對(duì)白三葉種子活力的影響測(cè)定方法 孢子懸浮液的制備 首先將PDA培養(yǎng)7 d的長(zhǎng)枝木霉孢子用無(wú)菌水清洗，配置成濃度為1.0×108個(gè)/mL孢子懸浮液備用。

孢子懸浮液對(duì)白三葉種子萌發(fā)率的測(cè)定 先將濃度為1.0×108個(gè)/mL的長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液分別稀釋成5個(gè)濃度梯度(1.0×107、5.0×106、2.0×106、1.0×106、5.0×105個(gè)/mL)，以無(wú)菌水為對(duì)照，共6個(gè)處理。在培養(yǎng)皿中放一張大小適宜的濾紙，每個(gè)皿中放入飽滿程度基本一致的白三葉種子40粒，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。再倒入2 mL配好的不同濃度的長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液，蓋上皿蓋，置于25 ℃，12 h/d光照的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此后每天對(duì)皿中噴2 mL的無(wú)菌水。10 d后，吸干白三葉種子表皮的水分，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，用直尺測(cè)量胚芽長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)。

1.2.2 白三葉種子抗逆性指標(biāo)的測(cè)定 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測(cè)定方法，過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[15，16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液對(duì)種子發(fā)芽率的影響

長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液對(duì)白三葉種子發(fā)芽率具有明顯的促進(jìn)作用，與對(duì)照相比不同濃度孢子懸浮液對(duì)種子發(fā)芽率的影響存在顯著的差異。長(zhǎng)枝木霉的孢子懸浮液在濃度為1.0×107，5×106和2.0×106個(gè)/mL的條件下可抑制白三葉種子的活力，在濃度為1.0×106、5.0×105個(gè)/mL下可以促進(jìn)白三葉種子的活力。孢子懸浮液濃度在1.0×106個(gè)/mL下白三葉種子發(fā)芽率最高，為93%，與對(duì)照(80%)相比增長(zhǎng)了16.25%。孢子懸浮液濃度在1.0×107個(gè)/mL白三葉種子發(fā)芽率最低，為35%，出現(xiàn)了負(fù)增長(zhǎng)，與對(duì)照80%相比增長(zhǎng)率為-56.25%。

圖1 不同濃度孢子懸浮液下白三葉種子的發(fā)芽率Fig.1 The effect of spore suspension with different concentrations on the seed germination rate

2.2 孢子懸浮液對(duì)胚根長(zhǎng)與胚芽長(zhǎng)的影響

不同濃度長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液對(duì)白三葉種子的胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。與對(duì)照相比胚根長(zhǎng)隨孢子濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)孢子濃度1.0×106個(gè)/mL時(shí)胚根長(zhǎng)為1.93 cm，與對(duì)照1.26 cm相比增長(zhǎng)了53.17%(表1)。濃度在1.0×106個(gè)/mL時(shí)胚芽長(zhǎng)為1.43 cm，與對(duì)照1.05 cm相比增長(zhǎng)了36.19%(表2)。

2.3 孢子懸浮液對(duì)白三葉種子抗逆性指標(biāo)的影響

2.3.1 丙二醛(MDA)含量 不同濃度長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液對(duì)白三葉MDA含量影響存在顯著的差異，與對(duì)照相比處理后白三葉MDA含量隨孢子懸浮液濃度的增加而逐漸減小。當(dāng)孢子懸浮液濃度為5.0×106個(gè)/mL時(shí)白三葉MDA含量最小，為1.012 μmol/g FW(圖2)。

表1 不同濃度的孢子懸浮液下的萌發(fā)種子的胚根長(zhǎng)Table1 The effect of spore suspension with different concentrations on the root hair length

表2 不同濃度的孢子懸浮液下種子的萌發(fā)胚芽長(zhǎng)Table2 The effect of spore suspension with different concentrations on the buds length

圖2 不同濃度孢子懸浮液下白三葉種子MDA含量Fig.2 The effect of spore suspension with different concentrations on MDA content

2.3.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性 PAL的活性隨著長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液的濃度變化而變化。在濃度為1.0×107、5.0×106個(gè)/mL時(shí)PAL活性與對(duì)照沒(méi)有顯著差異(P<0.05)。當(dāng)濃度為5.0×105個(gè)/mL時(shí)，PAL活性與對(duì)照相比差異顯著，且達(dá)到最大值2.157 U/g·min FW(圖3)。

圖3 不同濃度孢子懸浮液下白三葉種子PAL活性Fig.3 The effect of spore suspension with different concentrations on PAL activity

2.3.3 過(guò)氧化物酶(POD)活性 POD的活性隨著長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液的濃度變化有明顯的變化。在濃度為1.0×107個(gè)/mL時(shí)POD活性與對(duì)照相比有所降低。隨著濃度的降低POD的活性逐漸上升，當(dāng)濃度稀釋到1.0×106個(gè)/mL時(shí)達(dá)到最大值29.875 U/g FW，與對(duì)照存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 不同濃度孢子懸浮液下白三葉種子POD活性Fig.4 The effect of spore suspension with different concentrations on POD activity

3 討論與結(jié)論

北方地區(qū)白三葉的萌發(fā)率低，長(zhǎng)勢(shì)差，因此，促進(jìn)其萌發(fā)和生長(zhǎng)是當(dāng)前面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題。近年來(lái)Chang[17]通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)用泥土為基質(zhì)的哈茨木霉培養(yǎng)物或其分生的孢子懸浮液處理土壤后，辣椒、長(zhǎng)春花和菊花等植物均會(huì)有發(fā)芽率提高、開(kāi)花早而多、鮮重增加的現(xiàn)象。通過(guò)哈茨木霉T22和深綠木霉P1比較處理和未處理根的干鮮重、植株地上部分生物量、株高、葉和果實(shí)的數(shù)量，得出作物產(chǎn)量提高 300%[18]。試驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液在低濃度更能促進(jìn)生長(zhǎng)，在濃度1.0×106個(gè)/mL時(shí)，對(duì)白三葉的發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)的促生效果最明顯。這與劉云龍等[19]研究哈茨木霉對(duì)辣椒生長(zhǎng)和王建峰等研究木霉發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)黃瓜種子活力的結(jié)論基本相同[20]。

PAL對(duì)植物產(chǎn)生的木質(zhì)素等起到一定調(diào)節(jié)作用，與植物抗病性有關(guān)，而POD能將植物所產(chǎn)生的H2O2分解，所以與植物抗逆性有關(guān)[21]。不同的孢子懸浮液濃度對(duì)白三葉的POD和PAL酶活性有一定的影響，都可作為抗病生理指標(biāo)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。試驗(yàn)通過(guò)不同濃度的長(zhǎng)枝木霉菌孢子懸浮處理白三葉種子后，其POD和PAL酶活性發(fā)生了明顯變化，抗病性和抗逆性也隨之變化，且在一定范圍內(nèi)隨孢子懸浮液濃度的增加POD、PAL有所上升，表明適宜濃度處理白三葉種子后可有效提高其抗病性。MDA是膜脂過(guò)氧化作用產(chǎn)生的物質(zhì)，其含量越高說(shuō)明植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度高，細(xì)胞膜受到的傷害嚴(yán)重，反之則越輕微[21]。長(zhǎng)枝木霉菌孢子懸浮液濃度為5.0×106個(gè)/mL時(shí)，有效的降低了MDA的含量，從而降低白三葉種子的傷害程度，體現(xiàn)出長(zhǎng)枝木酶孢子懸浮液在促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面的潛能，即在適宜濃度下的長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液可以降低對(duì)種子的傷害提高植物的抗逆性活力，這將為擴(kuò)大農(nóng)業(yè)環(huán)境中長(zhǎng)枝木霉的應(yīng)用空間、應(yīng)用范圍提供有效的資源和依據(jù)。

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Effect ofTrichodermalongibrachiatumon seed growth and resistance of clover

YE Wei,XUE Ying-yu,XU Bing-liang,CHEN Long

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

The effect ofTrichodermalongibrachiatumon seeds growth and resistance of clover was studied by measuring the germination rates,root length and resistance of clover treated with different spores concentrations of T.longibrachiatum.The results showed that the vigor of clover seeds was increased after treated with the concentration of 5.0×105to 1.0×107spores/mL ofT.longibrachiatum.The germination rates,root length,shoot length were 93%,1.93 cm and 1.33 cm after treated with the concentration of 1.0×106spores/mL,and which were increased by 16.25%,53.1% and 27.8% compared to control(80%,1.26 cm,1.04 cm),respectively.The spore suspension ofT.longibrachiatumcould enhance the ability of seeds resistance to plant disease and unfavorable environment.The activity of phenylalanine(PAL) and peroxidase(POD) were increased after treated with the spore suspension,but the activity of methane dicarboxylic aldehyde(MDA) was decreased.The maximum activity of PAL and POD were 2.157 U/g(FW)·min and 29.875 U/g(FW) while the spore suspension concentrations were 5.0×105and 1.0×106spores/mL,respectively.The minimum activity of MDA was 1.012μmol/g(FW) treated with 5.0×106spores/mL.

Trichoderma;spore suspension;clover;growth promoting;resistance

2015-03-15；

2015-04-20

甘肅省高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(甘財(cái)教[2012]129號(hào))項(xiàng)目資助

葉巍(1989-),女,吉林省公主嶺市人，在讀碩士研究生。 E-mail：523133614@qq.com 薛應(yīng)鈺為通訊作者。

S 541.041

A

1009-5500(2015)04-0049-05