董文科，馬暉玲，陳春艷

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

不同消毒劑對甘肅紅豆草種子消毒效果及萌發(fā)的影響

董文科，馬暉玲，陳春艷

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究了3個(gè)不同種子預(yù)浸泡時(shí)間(6，12和24 h)，3種消毒劑(10% H2O2，30% NaClO和0.1% HgCl2)和3個(gè)不同消毒時(shí)間(10，20和30 min)對甘肅紅豆草種子萌發(fā)率、污染率及發(fā)芽指數(shù)的影響，以獲取甘肅紅豆草無菌苗時(shí)種子的最佳消毒方法。結(jié)果表明，3個(gè)因素對發(fā)芽率影響差異顯著；預(yù)浸泡時(shí)間對發(fā)芽指數(shù)影響差異極顯著，而對污染率影響差異不顯著；消毒劑種類及消毒時(shí)間對污染率和發(fā)芽指數(shù)影響差異顯著。綜合各項(xiàng)因素，室溫條件下無菌水預(yù)浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min種子發(fā)芽率較高，污染率較低，發(fā)芽較快且出苗整齊，是獲取甘肅紅豆草無菌苗種子的最佳消毒方式。

消毒劑；紅豆草；萌發(fā)；污染

在植物細(xì)胞工程試驗(yàn)中，以無菌種苗作為外植體，獲得愈傷組織和再生植株，進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作；為了獲得高質(zhì)量的RNA，常選擇幼嫩的無菌苗為RNA提取的試驗(yàn)材料[1]。

甘肅紅豆草(Onobrychisviciaefoliacv.Gansu)屬多年生豆科牧草，是由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位選育出的對甘肅生境有較強(qiáng)適應(yīng)性的品種[2]。其莖葉茂盛，草質(zhì)柔嫩，含有豐富的維生素和礦物質(zhì)，適口性好，各類家畜均喜食[3]，是優(yōu)質(zhì)牧草之一[4]。在植物基因工程研究中，紅豆草又作為優(yōu)良基因的重要來源[5]。所以，紅豆草種子的消毒及無菌苗的培養(yǎng)在植物細(xì)胞工程試驗(yàn)中發(fā)揮著十分重要的作用。通過研究不同的消毒劑對甘肅紅豆草種子消毒效果及種子萌發(fā)等的影響，為甘肅紅豆草無菌種苗的培養(yǎng)、高效再生體系的建立和優(yōu)良基因的轉(zhuǎn)化提供有益參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

甘肅紅豆草，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

MS培養(yǎng)基所用的無機(jī)鹽、蔗糖以及瓊脂為國產(chǎn)分析純，各種維生素和激素購自上海生工生物有限公司，試驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

將甘肅紅豆草飽滿種子，室溫下，用無菌水預(yù)浸泡不同時(shí)間后，75%的乙醇浸泡30 s，不同消毒劑浸泡處理，按3因素3水平正交試驗(yàn)，正交表選用L9(34)[6](表1)，然后用無菌水反復(fù)沖洗5～6次，用無菌濾紙吸干種子表面水分，接種于MS培養(yǎng)基上，每瓶15粒，6 次重復(fù)，25 ℃、光照14 h/d(光照強(qiáng)度2000 lx)的恒溫箱下萌發(fā)。試驗(yàn)期間，觀察記錄紅豆草種子發(fā)芽與污染情況，發(fā)芽數(shù)逐日統(tǒng)計(jì)，第7 d以后萌發(fā)率已基本不變，計(jì)算發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)L9(34)表頭設(shè)計(jì)Table1 Orthogonal design

1.3 數(shù)據(jù)分析

種子發(fā)芽率=正常發(fā)芽的種子粒數(shù)/供試種子總粒數(shù)×100%

污染率=染菌株數(shù)/總株數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)(Gi)=ΣGt/Dt

式中：Gt為在時(shí)間t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽日數(shù)。

以SPSS 19統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素對甘肅紅豆草種子發(fā)芽率影響分析

不同因素水平極差(R)的大小，說明該因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度。各因素對甘肅紅豆草發(fā)芽率影響的直觀分析結(jié)果表明，不同因素對甘肅紅豆草發(fā)芽率影響的主次關(guān)系為消毒時(shí)間>消毒劑種類>預(yù)浸泡時(shí)間(表2)。結(jié)合方差分析，3個(gè)因素對甘肅紅豆草發(fā)芽率均有顯著意義(P<0.05)，且影響大小為，消毒時(shí)間>消毒劑種類>預(yù)浸泡時(shí)間，與直觀分析結(jié)果一致(表3，4)。對3個(gè)因素采用LSD多重比較(表3)，結(jié)果表明，不同預(yù)浸泡時(shí)間對發(fā)芽率影響差異顯著，發(fā)芽率由高到低為24，12和6 h。消毒劑種類對發(fā)芽率影響差異顯著，發(fā)芽率由高到低為0.1% HgCl2，30% NaClO和10% H2O2。消毒時(shí)間對發(fā)芽率影響差異顯著，發(fā)芽率由高到低為20 min，10 min和30 min。試驗(yàn)分析可得，獲得最高發(fā)芽率的最優(yōu)消毒方案為預(yù)浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min，紅豆草種子發(fā)芽率為67.78%。

2.2 各因素對甘肅紅豆草種子污染率影響分析

各因素對污染率直觀分析(表3)表明，對甘肅紅豆草污染率影響的極差大小為RB>RC>RA，不同因素對甘肅紅豆草污染率影響的主次關(guān)系為消毒劑種類>消毒時(shí)間>預(yù)浸泡時(shí)間。結(jié)合方差分析(表4)，消毒劑的種類對污染率的差異極顯著(P<0.01)，消毒時(shí)間對污染率的差異具有顯著影響(P<0.05)，而預(yù)浸泡時(shí)間對污染率影響差異不顯著(P>0.05)，3個(gè)因素影響大小為消毒劑種類>消毒時(shí)間>預(yù)浸泡時(shí)間，與直觀分析結(jié)果一致。對3個(gè)因素采用LSD多重比較(表3)，結(jié)果表明0.1% HgCl2，30% NaClO和10% H2O2之間對污染率影響差異極顯著；消毒20 min和30 min與消毒10 min之間差異顯著，而消毒20 min和30 min差異不顯著。各項(xiàng)分析比較可得，獲得最低污染率的最優(yōu)消毒方案為：0.1% HgCl2消毒20 min或30 min，但消毒30 min會(huì)使發(fā)芽率降低，因此，采用0.1% HgCl2消毒20 min。

表2 正交試驗(yàn)L9(34)試驗(yàn)結(jié)果Table2 Result of orthogonal experiment

表3 正交設(shè)計(jì)直觀分析和多重比較Table3 Result of direct analysis and multiple comparison

注：L表示每個(gè)水平相同因子的估算邊際平均值，R表示每個(gè)因子估算邊際平均值的極差；不同大、小寫字母分別表示0.01水平顯著(F≥F0.01)和0.05水平顯著(F≥F0.05)

2.3 各因素對甘肅紅豆草種子發(fā)芽指數(shù)影響分析

各因素對發(fā)芽指數(shù)直觀分析(表3)表明，對甘肅紅豆草發(fā)芽指數(shù)影響的極差大小為：RA>RB>RC，不同因素對甘肅紅豆草發(fā)芽指數(shù)影響的主次關(guān)系預(yù)浸泡時(shí)間>消毒劑種類>消毒時(shí)間。結(jié)合方差分析(表4)，預(yù)浸泡時(shí)間對發(fā)芽指數(shù)的影響差異極顯著(P<0.01)，消毒劑的種類和消毒時(shí)間對發(fā)芽指數(shù)影響差異顯著(P<0.05)，3個(gè)因素影響大小為預(yù)浸泡時(shí)間>消毒劑種類>消毒時(shí)間，與直觀分析結(jié)果一致。對3個(gè)因素采用LSD多重比較(表3)，結(jié)果表明，預(yù)浸泡24 h與預(yù)浸泡6 h和12 h之間對發(fā)芽指數(shù)影響差異顯著；10% H2O2和30% NaClO與 0.1% HgCl2之間對發(fā)芽指數(shù)影響差異顯著，而10% H2O2和30% NaClO差異不顯著，但從降低污染率考慮，30% NaClO消毒效果優(yōu)于10% H2O2，因此，常選用30% NaClO；消毒20，30 和10 min之間差異顯著，而消毒20 min和30 min差異不顯著，但從降低污染率考慮，消毒30 min效果優(yōu)于20 min。因此，獲得較高發(fā)芽指數(shù)的最優(yōu)消毒方案為：預(yù)浸泡24 h、30% NaClO消毒30 min。

表4 正交試驗(yàn)方差分析Table4 Result of variance analysis

注：**表示0.01水平顯著(F≥F0.01)，*表示0.05水平顯著(F≥F0.05)

3 討論和結(jié)論

試驗(yàn)中種子消毒，選擇合適的消毒劑和消毒時(shí)間是獲得無菌苗的關(guān)鍵因素。判斷某種消毒方法是否合適，要綜合考慮發(fā)芽率、污染率、發(fā)芽勢等因素[7-10]。試驗(yàn)中得出，3個(gè)指標(biāo)最優(yōu)方案分別為預(yù)浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min發(fā)芽率最高；預(yù)浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min污染率最低；預(yù)浸泡24 h、30% NaClO消毒30 min發(fā)芽指數(shù)最高。但30% NaClO消毒30 min污染率高達(dá)18.89%，而且消毒時(shí)間太長會(huì)使種子由褐色變?yōu)辄S色，對種子造成一定損傷[11]。綜合考慮種子萌發(fā)情況和污染情況，試驗(yàn)最佳消毒方案為無菌水預(yù)浸泡24 h、0.1% HgCl2消毒20 min。

研究表明，HgCl2作為消毒劑其消毒效果最好[12]，然而HgCl2可以使蛋白質(zhì)變性，其對植物的毒性較大。經(jīng)過HgCl2處理的種子，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢均不高，但這種消毒方法處理操作相對簡便，抑菌效果穩(wěn)定，所以被廣泛作為較大體積種子的消毒劑[13]。對于紅豆草這種體積較大，并且種皮上附著大量內(nèi)生真菌的種子[14]，HgCl2消毒是最佳的選擇。

有資料報(bào)道，油菜(Brassicanapus)、月季(Rosahvbrida)、生姜(Zingiberofficinale)的外植體除了采用常規(guī)的消毒方法外，還有使用抗生素、抗菌素等抑菌藥劑處理外植體，具有一定的抑菌效果[15-17]。至于其他消毒劑對甘肅紅豆草種子的消毒效果和影響，仍有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of different disinfectants on seed sterilization and germination ofOnobrychisviciaefoliacv.Gansu

DONG Wen-ke,MA Hui-ling,CHEN Chun-yan

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

Experiments with orthogonal design were carried out to explore an optimal sterilizing method forOnobrychisviciaefoliaseeds through pre-soaking (6,12,24 h) and different disinfectants (10% H2O2,30% NaClO,0.1% HgCl2) and sterilizing time (10,20,30 min),The germination,contamination rate and germination index of were measured.The results showed that all factors had the significant effects on germination;the pre-soaking time had the most significant effects on germination,but it was not significant on contamination .The disinfectants and sterilizing time had significant effects on contamination and germination .Therefore,the best treatment was pre-soaking in sterilized distilled water for 24 h at room temperature,and then to treat the seed with 0.1% (w/v) aqueous mercuric chloride for 20 min .

disinfectants;Onobrychisviciaefolia;germination;contamination

2014-10-21；

2015-01-04

甘肅省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(1104 NKCA087)資助

董文科(1990-)，男，甘肅金昌人，在讀碩士。 E-mail：602105125@qq.com 馬暉玲為通訊作者。

S 541

A

1009-5500(2015)02-0080-04