李 悅，師尚禮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

秋水仙素處理對(duì)根莖型清水紫花苜蓿抗旱性的影響

李 悅，師尚禮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

采用0.05%，0.1%和0.2% 3個(gè)濃度秋水仙素對(duì)根莖型清水紫花苜蓿種子進(jìn)行4 h處理，在幼苗3～4葉期進(jìn)行干旱脅迫，通過測(cè)定脅迫0、3、6、9及12 d復(fù)水后葉片相對(duì)含水量(RWC)、丙二醛(MDA)、游離脯氨酸(Pro)及葉綠素含量，研究不同濃度處理下清水紫花苜蓿對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力。結(jié)果表明：隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，清水紫花苜蓿葉片RWC及葉綠素含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，且均在0.2%處理下降低最小；而MDA及Pro含量呈不同程度增加，但MDA含量在0.1%處理下積累最少，而Pro含量在0.2%處理下積累最多。同時(shí)，對(duì)各處理植株的葉片RWC、Pro含量、MDA含量及葉綠素含量4個(gè)生理生化指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，得出不同濃度秋水仙素處理的根莖型清水紫花苜蓿植株抗旱性強(qiáng)弱順序?yàn)椋?.1%>0.05%>0.2%>CK。

根莖型清水紫花苜蓿；秋水仙素；抗旱性

紫花苜蓿(Medicagosativa)是重要的豆科牧草，因具有葉量大、葉莖比高、粗蛋白含量高、品質(zhì)好、抗性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種全球性栽培、適應(yīng)性廣泛、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性優(yōu)良的飼料作物。根莖型紫花苜蓿是紫花苜蓿的一個(gè)變型，其根頸部較長(zhǎng)，形成根莖混雜區(qū)，根頸距地表相對(duì)較深，并從其根頸區(qū)發(fā)育出類似根狀的莖，萌發(fā)新芽與幼根，出土形成新的植株，是培育放牧型苜蓿的良好材料，具有許多栽培苜蓿所不具有的植物學(xué)和生物學(xué)特征[1,2]。在我國(guó)，苜蓿也是許多農(nóng)牧區(qū)的首選草種[3]。苜蓿產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程不斷推進(jìn)，對(duì)農(nóng)民增加收入和生態(tài)環(huán)境建設(shè)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4,5]。但苜蓿是一種相對(duì)需水的作物，優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的獲得與水資源供應(yīng)和品種抗旱能力強(qiáng)弱存在直接關(guān)系[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)干旱及半干旱地區(qū)面積占全國(guó)總耕地面積的48%，干旱已成為影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要限制因子[7]，近年來由于環(huán)境惡化、氣溫轉(zhuǎn)暖、水資源缺乏導(dǎo)致各地旱情頻發(fā)，抗旱性強(qiáng)的苜蓿品種在生產(chǎn)實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用。因此，系統(tǒng)開展優(yōu)質(zhì)抗旱苜蓿品種的篩選及其抗旱性鑒定與評(píng)價(jià)的研究，對(duì)指導(dǎo)我國(guó)干旱、半干旱地區(qū)苜蓿產(chǎn)業(yè)化穩(wěn)步發(fā)展尤為必要，并具有現(xiàn)實(shí)意義。

參照植物抗旱性鑒定方法與指標(biāo)，通過溫室盆栽控水的方式模擬土壤干旱脅迫條件下，測(cè)定不同濃度(0.05%，0.1%和0.2%)秋水仙素處理后的根莖型清水紫花苜蓿植株葉片的相對(duì)含水量(RWC)、丙二醛(MDA)含量、游離脯氨酸(PRO)及葉綠素含量，并對(duì)4個(gè)生理生化指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，客觀評(píng)價(jià)各處理根莖型清水紫花苜蓿的抗旱性，旨在為通過秋水仙素誘變獲得的苜蓿新品種的高產(chǎn)栽培提供一定的理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)計(jì)

1.1.1 試驗(yàn)材料 供試品種為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院育成的國(guó)審品種根莖型清水紫花苜蓿，種子由草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 挑選大小均勻，飽滿的種子用蒸餾水浸泡一段時(shí)間，選擇吸脹的種子整齊地?cái)[放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中(直徑9 cm，80粒/皿)，加入適量蒸餾水，以不能流動(dòng)為宜，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)并及時(shí)補(bǔ)給水分。待種子露白，分別用濃度為0.05%(T1處理)、0.1%(T2處理)、0.2%(T3處理)的秋水仙素溶液浸泡4 h后放入恒溫培養(yǎng)箱25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，以蒸餾水處理作為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理9次重復(fù)，待80%的種子發(fā)芽后于花盆中進(jìn)行盆栽(外口徑為30 cm；內(nèi)口徑為26 cm，高20 cm，每盆50粒，共36盆)，每盆分裝沙土8 kg，每天觀察并每隔兩天澆灌霍格蘭氏(Hoagland’s)營(yíng)養(yǎng)液，以確保苜蓿苗生長(zhǎng)過程所需的氮、磷、鉀等元素。待幼苗長(zhǎng)至三到四葉期時(shí)開始干旱脅迫，分別于停水當(dāng)天(0 d)和干旱脅迫第3、6、9 d及第12 d復(fù)水后的上午9∶00采樣(同部位的葉片)，并測(cè)定其生理生化指標(biāo)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1)葉片相對(duì)含水量(RWC) 采用稱重法[8]；2)游離脯氨酸(Pro)含量的測(cè)定參考鄒琦[8]的方法；3)丙二醛(MDA)含量的測(cè)定參考王學(xué)奎[9]的方法；4)葉綠素含量的測(cè)定采用吸光光度法(根據(jù)修正的Arnon公式進(jìn)行計(jì)算)[10]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

ST采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度秋水仙素處理后葉片相對(duì)含水量變化

逆境條件下植物葉片相對(duì)含水量可反映植物的保水能力，是標(biāo)志植物水分狀況的重要指標(biāo)[11]。隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各濃度秋水仙素處理的葉片相對(duì)含水量均呈降低趨勢(shì)，且均較對(duì)照高。非干旱脅迫下，T3與CK及T1處理的葉片相對(duì)含水量均差異顯著(P<0.05)，而其他各處理間差異不顯著。脅迫3 d時(shí)，T2與T3處理的葉片相對(duì)含水量與對(duì)照有顯著差異(P<0.05)，其他處理之間差異不顯著；脅迫6 d時(shí)，葉片RWC含量在CK及T1處理下與T2與T3處理有顯著差異(P<0.05)，而其他處理間無顯著差異；脅迫9 d時(shí)，各誘變處理的葉片RWC含量均與對(duì)照之間差異顯著，與非脅迫條件下相比，RWC含量分別降低了28.08%、26.16%、25.46%、18.96%(表1)。復(fù)水后葉片RWC含量恢復(fù)，但仍比未脅迫時(shí)有較小降幅。結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度秋水仙素誘變處理的苜蓿葉片保水力強(qiáng)于對(duì)照，且T3處理下葉片相對(duì)含水量下降最少。

表1 不同濃度秋水仙素誘變后葉片相對(duì)含水量Table1 The RWC contents of leafs induced by different concentrations of colchicine %

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同

2.2 不同濃度秋水仙素處理對(duì)葉片丙二醛含量的影響

隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理下葉片的MDA含量都出現(xiàn)不同程度積累。其中，3 d與9 d脅迫下，T2、T3處理的葉片MDA含量與CK、T1處理之間均有顯著差異(P<0.05)，但T2、T3差異不顯著，CK、T1差異顯著(P<0.05)；6 d脅迫下，不同處理之間葉片MDA含量均差異顯著，且均較非脅迫條件下有不同積累；且T2處理的葉片MDA含量增幅均最小，為0.80%(3 d)、4.59%(6 d)7.31%(9 d)；復(fù)水后T3處理的葉片MDA含量與對(duì)照差異顯著(P<0.05)，并且各處理MDA含量較對(duì)照有小幅度增加。說明干旱脅迫對(duì)T2處理的植株傷害程度較小(表2)。

表2 不同濃度秋水仙素處理后的葉片丙二醛含量Table2 The MDA contents of leafs induced by different concentrations of colchicine μg/g EW

2.3 不同濃度秋水仙素處理對(duì)葉片游離脯氨酸含量的影響

隨著脅迫時(shí)間的增加，不同濃度秋水仙素處理下葉片Pro出現(xiàn)不同程度積累，葉片Pro含量在不同濃度不同脅迫時(shí)間之間均差異顯著(P<0.05)。干旱脅迫3，6和9 d時(shí)，T3處理葉片Pro含量均較非脅迫條件增加幅度最大，分別為52.24%，92.26%和118.61%；復(fù)水后各處理葉片Pro含量小于脅迫時(shí)的水平，但仍有小幅度積累，且在T3處理增幅最大，為21.55%(圖1)。由此可知，T3處理下的苜蓿葉片內(nèi)Pro含量積累最多，適應(yīng)干旱脅迫能力更強(qiáng)。

吉非替尼（gefitinib）是首個(gè)選擇性表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑，自2002年首先在日本上市，現(xiàn)已廣泛用于既往接受過化療或不適于化療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌的一線治療藥物。間質(zhì)性肺?。╥nterstitial lung disease，ILD）是其嚴(yán)重的不良反應(yīng)，致死率較高[1]。目前，吉非替尼致ILD死亡的危險(xiǎn)因素尚未見報(bào)道，現(xiàn)以國(guó)內(nèi)外吉非替尼致ILD個(gè)案報(bào)道的文獻(xiàn)為基礎(chǔ)，探討該藥致ILD死亡的危險(xiǎn)因素，以便于臨床更加安全使用提供參考。

圖1 不同濃度秋水仙素處理后的葉片Pro含量Fig.1 The Pro contents of leafs induced by different concentrations of colchicine

2.4 不同濃度秋水仙素誘變后苜蓿葉片葉綠素含量

不同處理之間葉片葉綠素含量均差異顯著(P<0.05)，且隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理葉片葉綠素含量呈現(xiàn)不同程度降低趨勢(shì)(圖2)。其中脅迫9 d時(shí)下降程度最大，CK、T1、T2及T3處理葉片葉綠素含量均較非干旱脅迫下降低了25.75%、22.01%、17.47%、17.33%。由此可知，T3處理的葉綠素含量下降最為緩慢，干旱脅迫對(duì)其傷害程度也最小。

2.5 秋水仙素各處理下清水苜蓿抗旱性的綜合評(píng)價(jià)

牧草對(duì)干旱環(huán)境的適應(yīng)具有多樣性和復(fù)雜性，其抗旱能力強(qiáng)弱也難以用某一通用指標(biāo)來評(píng)價(jià)，因此，研究中需要多種指標(biāo)相結(jié)合，綜合分析干旱脅迫對(duì)苜?？购敌缘挠绊?。以葉片RWC、MDA含量、Pro含量和葉綠素含量4個(gè)指標(biāo)為依據(jù)，應(yīng)用Fuzzy數(shù)學(xué)中隸屬度函數(shù)法[8,12]進(jìn)行綜合評(píng)判，與抗旱性呈正相關(guān)的指標(biāo)RWC、葉綠素、Pro采用以下公式計(jì)算。

圖2 不同濃度秋水仙素處理后的葉片葉綠素含量Fig.2 The Chlorophy II contents of leafs induced by different concentrations of colchicine

Fij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

對(duì)與抗旱性呈負(fù)相關(guān)的MDA采用公式計(jì)算。

Fij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

3 討論與結(jié)論

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過研究報(bào)道，牧草在干旱的環(huán)境下各生理生化指標(biāo)如RWC，Pro和MDA含量、葉綠素含量等都會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化以適應(yīng)干旱脅迫。

表3 秋水仙素不同濃度處理的苜蓿各指標(biāo)隸屬函數(shù)值及綜合評(píng)價(jià)值Table3 The subordinate function values and comprehensive evaluaticm values of different colchicines concentration treatment to alfalfa

RWC是反映植物抗旱性強(qiáng)弱的一項(xiàng)重要指標(biāo)，可以有效地保持葉綠體的結(jié)構(gòu)和PsⅡ功能，使植物進(jìn)行有效的光合作用[13]。RWC越大，下降速率越小，則抗旱性越強(qiáng)。李崇巍等[14]研究表明，能維持較高相對(duì)含水量的植物，其抗旱能力亦較強(qiáng)。蒲光蘭等[15]試驗(yàn)得知，杏(Prunusarmeniaca)在水分脅迫初期，RWC下降較緩；脅迫至末期，下降速率開始加快，隨脅迫增加，凈光合速率出現(xiàn)負(fù)值，不再積累光合產(chǎn)物，反而呈消耗代謝，生長(zhǎng)停滯。試驗(yàn)結(jié)果表明：隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理葉片RWC呈下降趨勢(shì)，其中T3處理下的RWC降低最小。

MDA作為膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞膜起傷害作用[16]，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度，即膜脂過氧化程度隨品種抗旱性下降而加劇[17]，因此，MDA積累量的高低能夠在一定程度上反應(yīng)出植物體受干旱脅迫后自身的受損害程度，即對(duì)干旱脅迫的承受能力。試驗(yàn)表明：隨著干旱脅迫程度的加劇，各處理葉片MDA產(chǎn)生不同程度積累。其中以T2處理下MDA含量增加最少，說明干旱脅迫對(duì)植株傷害程度較小。

Pro是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，其含量的變化是植物對(duì)逆境條件的一種適應(yīng)性變化[18]。當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，尤其是干旱時(shí)造成體內(nèi)脯氨酸積累。抗旱性強(qiáng)的植物Pro積累時(shí)間長(zhǎng)，積累量也較大[17-19]。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著脅迫時(shí)間的增加不同濃度秋水仙素處理的葉片Pro含量出現(xiàn)不同程度積累，其中以T3處理下葉片內(nèi)Pro含量積累最多，說明處理植株適應(yīng)干旱脅迫能力較強(qiáng)。

干旱脅迫下葉片葉綠素含量隨著脅迫強(qiáng)度的增大而降低，缺水不僅影響葉綠素的生物合成，而且促進(jìn)已形成的葉綠素的加速分解，導(dǎo)致葉片發(fā)黃，在一定范圍內(nèi)葉綠素含量高低則直接影響葉片的光合作用能力，從而影響作物產(chǎn)量[20]。試驗(yàn)顯示，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，不同濃度秋水仙素處理使葉片葉綠素含量出現(xiàn)不同程度降低，其中，脅迫9 d時(shí)下降程度最大，T3處理的植株葉片葉綠素含量下降最為緩慢，說明干旱脅迫對(duì)其傷害程度也最小。

植物抗旱性是一個(gè)受多種因素影響的復(fù)雜數(shù)量性狀，不同植物對(duì)某一具體指標(biāo)的抗旱性反應(yīng)不一定相同，其評(píng)價(jià)方法很多，其中，隸屬函數(shù)分析提供了1條在多指標(biāo)測(cè)定基礎(chǔ)上對(duì)苜?？购敌赃M(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的途徑，避免了單一指標(biāo)的片面性。因此，試驗(yàn)運(yùn)用Fuzzy數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)綜合評(píng)判法[6,10]，對(duì)各誘變處理苜蓿的葉片RWC、Pro、MDA含量及葉綠素含量4個(gè)生理生化指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，得出不同濃度秋水仙素處理的清水紫花苜蓿植株抗旱性強(qiáng)弱順序?yàn)椋篢2>T1>T3>CK。說明，經(jīng)過不同濃度秋水仙素處理的植株抗旱性整體較對(duì)照植株有所增強(qiáng)，為今后利用秋水仙素為化學(xué)誘變劑對(duì)清水紫花苜蓿品種進(jìn)行誘變加倍育種，獲得抗性更強(qiáng)的新品種奠定了一定的基礎(chǔ)。

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The preliminary research of different colchicine concentration treatments on the drought resistance of RhizomatousMedicagosativacv.Qingshui

LI Yue,SHI Shang-li

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainabilityLanzhou730070)

This paper used four treatments of different concentrations of colchicine(0.05%、0.1%、0.2%) to treat seeds of Medicago sativa cv.Qingshui for 4 hours and conducted drought stress when the seedlings was in 3～4 leaf stage.The contents of RWC,MDA,PRO and Chlorophyll in leaves under drought stress were measured on 0 d、3 d、6 d、9 d and rewater after 12 d.The results showed that the contents of RWC,and Chlorophyll of plant leaves were decreasing,and the lowest values were in the colchicine with 0.2%;MDA and Pro were increasing.However,MDA had a least accumulation under the treatment with 0.1%,and Pro had a most accumulation under the treatment with 0.2%.Meanwhile,based on the comphensive analyse of RWC,MDA,PRO and Chlorophyll,the rank of colchicine concentrations on the drought resistance of Qingshui alfalfa was: 0.1%>0.05%>0.2%>CK.

RhizomatousMedicagosativacv.Qingshui;Colchicine;drought resistance

2014-12-22；

2015-04-10

農(nóng)業(yè)部牧草種質(zhì)資源保種項(xiàng)目(NB2130135)資助

李悅(1989-)，女，甘肅會(huì)寧人，在讀碩士研究生。 E-mail：807653824@qq.com 師尚禮為通訊作者。

S 541

A

1009-5500(2015)04-0070-05