皇甫長梅，王麗姝，李尚妹，陶靜莉，劉偉敬，劉華鋒*

(1.暨南大學附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州510630；2.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院 腎臟疾病研究所，廣東 湛江524001)

成人腎病綜合征患者腎小管megalin表達變化及其可能機制探討

皇甫長梅1，王麗姝2，李尚妹2，陶靜莉2，劉偉敬2，劉華鋒2*

(1.暨南大學附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州510630；2.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院 腎臟疾病研究所，廣東 湛江524001)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0557)

megalin是腎小管上皮細胞內(nèi)吞蛋白質(zhì)的主要受體，主要分布在腎臟近端腎小管刷狀緣[1,2]，與Cublin共同構(gòu)成Megalin/Cublin受體復合體，介導濾入腎小管腔中蛋白質(zhì)的重吸收[3-6]。已陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，某些人類腎臟疾病患者及動物腎病模型腎小管megalin表達異常[7-12]，例如遺傳性疾病Dent氏病和Fanscon綜合征患者腎組織megalin表達減少[7,8]，而慢性腎衰竭狗模型[11]以及糖尿病腎病大鼠模型腎組織[12]megalin表達也明顯減少，這說明腎小管Megalm表達異常是多種腎臟病的表現(xiàn)之一。腎病綜合征以腎小球濾過膜受損、大量血漿蛋白漏出和腎小管重吸收部分漏出蛋白以及臨床上排泄蛋白尿為特征，這些患者的腎組織megalin表達是否發(fā)生變化，以及megalin表達與腎小球損傷程度和病理類型是否存在相關(guān)關(guān)系？至今罕見相關(guān)研究報道。在本研究中，本研究通過探討不同病理腎病綜合征患者腎小管megalin表達是否存在差異，以期進一步探討腎病綜合征患者蛋白尿形成和腎小管損傷的發(fā)生機制。

1資料與方法

1.1研究對象選取2010年5月至2012年10月期間在廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科住院診斷為原發(fā)性腎病綜合征患者62例(男:41例，女：21例)。對照組腎組織11例，主要來自因腎腫瘤切除腎臟而且遠離腫瘤的腎臟組織。(1)腎病綜合征納入標準：臨床符合為“三高一低”診斷標準，其中必備條件包括：①24小時尿蛋白>3.5 g/d，②血漿白蛋白<30 g/L，并經(jīng)腎穿刺活檢明確病理類型。(2)排除標準：①年齡小于14歲，或超過70歲；②紫癜性腎炎、乙肝病毒相關(guān)性腎炎、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病、銀屑病相關(guān)腎炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎腎損害以及腫瘤相關(guān)性腎病等繼發(fā)性腎病綜合征；③合并嚴重感染、急性腎衰竭、栓塞以及合并嚴重心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病、急性濕疹等；④腎穿刺活檢前3個月內(nèi)曾用激素及免疫抑制劑治療。

1.2實驗方法

1.2.1標本采集與保存常規(guī)進行腎臟穿刺術(shù)取得腎病綜合征患者腎臟組織，經(jīng)固定脫水包埋后石蠟固定于-80℃冰箱中凍存。所有標本檢測前均無反復凍融。

1.2.2血清、尿液生化指標測定應用全自動生化分析儀測定尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白蛋白(ALB)、膽固醇(CH)等；應用全自動血細胞分析儀測定血紅蛋白(Hb)；24小時尿蛋白定量用磺基水楊酸法測定。

1.2.3腎組織megalin表達檢測應用免疫組織化學方法檢測腎小管刷狀緣megalin的表達。兔抗人megalin多克隆抗體購于美國Sigma公司，DAB試劑盒購于武漢博士德公司，兔二步法檢測試劑盒(PV-6003)購于北京中杉金橋生物公司。根據(jù)試劑商提供的說明書操作，簡要如下：3 μm厚石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，于0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)中微波熱修復抗原。用正常山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點，滴加一抗(1∶50稀釋)4℃孵育過夜。次晨PBS洗滌后加二抗(非生物素PV-6003)室溫孵育60 min，PBS沖洗后滴加DAB顯色，最后蘇木素復染及中性樹膠封片。各組標本隨機取兩例作陰性對照，染色方法同上，用PBS代替一抗。結(jié)果判定：細胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色染色為陽性。人工計數(shù)法半定量分析megalin表達量，簡要步驟如下：根據(jù)細胞刷狀緣著色深度及陽性小管數(shù)分別記分為0～3 分，著色深度以多數(shù)細胞呈色程度為準。著色深度：淺棕色者為1 分、棕色者2 分、深棕色者為3 分、不著色為0 分；陽性小管百分比：整塊切片中陽性小管占所有小管中的比例< 30 %為1 分、30 %～70 %為2 分、> 70 %為3 分、無細胞著色為0分。最后分值：陽性小管百分比分值乘以著色深度分值。400倍光鏡下，每張切片隨機選取10個不同的視野。每個視野根據(jù)上述評分標準進行評分，一個視野一個評分，10個視野的平均分作為一張切片的平均分。

1.2.4腎臟病理常規(guī)檢查和腎間質(zhì)損傷程度評分腎組織用福爾馬林固定，石蠟包埋，制成3 μm厚切片，行HE、PASM和MASSON染色。按 以下4 個指標計算腎小管-間質(zhì)損傷指數(shù)：①腎小管變性、壞死；②腎小管萎縮；③間質(zhì)炎癥細胞浸潤；④間質(zhì)纖維化。根據(jù)病變的范圍及嚴重程度，按無 、輕度(<2 5% )、中度(25%-5 0 % )、重度(>50% )分別計分為0、1、2、3分。

2結(jié)果

2.1不同病理類型腎病綜合征患者腎小管megalin表達比較免疫組化結(jié)果顯示，腎組織megalin表達主要分布于近端腎小管上皮細胞的刷狀邊緣，見圖1。經(jīng)免疫組化半定量分析，結(jié)果顯示：MCD組腎小管上皮細胞megalin表 差異；而MN組、FSGS組腎小管megalin表達均比對照組顯著降低，也顯著低于MCD組(P<0.05,P<0.01)；而FSGS組megalin表達較MN組降低(P<0.05)，見表1和圖1。

表1　不同病理類型腎綜患者腎小管megalin的表達

vs contril，*P<0.05，**P<0.01；vs MCD group，#P<0.05，##P<0.01；vsMNgroup，&P<0.05。

圖1　　不同病理類型腎綜患者腎小管megalin的

2.2腎病綜合征患者腎小管megalin表達水平與臨床指標相關(guān)性分析全組腎病綜合征患者腎小管megalin的表達水平與尿蛋白定量、血清白蛋白、血肌酐、血尿素氮、膽固醇、甘油三酯、血紅蛋白和年齡等臨床指標無相關(guān)關(guān)系；各病理類型亞組腎小管megalin的表達水平也與臨床指標無顯著相關(guān)關(guān)系，如表2。

2.3腎病綜合征患者腎小管megalin表達水平與腎小管損傷評分的相關(guān)性比較全組megalin、MCD亞組megalin、MN亞組megalin表達水平均與腎小管損傷評分存在負相關(guān)關(guān)系；全組megalin、MCD亞組megalin、MN亞組megalin表達水平均與腎小管萎縮評分存在負相關(guān)關(guān)系；全組megalin、MCD亞組

表2　腎綜患者腎小管Megalin的表達水平與臨床指標的相關(guān)性分析

megalin表達水平均與間質(zhì)炎癥細胞浸潤評分存在負相關(guān)關(guān)系；全組megalin、MCD亞組megalin、 MN亞組megalin表達水平均與間質(zhì)纖維化評分存在負相關(guān)關(guān)系。見表3。

表3　腎小管megalin表達與小管損傷評分相關(guān)性

3討論

在本研究中，我們采用免疫組化方法對不同病理類型腎病綜合征患者腎小管megalin的表達情況進行初步探討。雖然本組三種病理類型腎病綜合征患者均表現(xiàn)為大量蛋白尿和嚴重低蛋白血癥，腎功能損害程度也基本相近，但我們的檢測結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，MCD患者腎小管megalin表達無明顯變化，而MN患者及FSGS患者腎小管megalin表達量顯著降低，以FSGS最為嚴重，甚至部分FSGS患者腎小管上皮細胞megalin幾乎完全丟失。眾所周知，這三種病理類型腎病綜合征的原發(fā)病變在腎小球，而腎小管-間質(zhì)損傷主要是繼發(fā)于尿蛋白的毒性，因此，從該結(jié)果可以推測：不同病理類型腎病綜合征患者尿蛋白對患者腎小管的損傷可能不同。進一步的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，腎病綜合征患者腎小管megalin表達量與患者尿蛋白排泌量以及其它生化指標卻基本無相關(guān)關(guān)系，而與腎小管損傷總評分以及與腎小管萎縮評分、間質(zhì)炎癥細胞浸潤評分和間質(zhì)纖維化評分呈顯著負相關(guān)關(guān)系，進一步驗證上述的推斷。事實上，在臨床實踐中，腎病?？婆R床工作者常常會發(fā)現(xiàn)： FSGS患者腎小管-間質(zhì)損傷普遍比較突出，而MCD患者腎小管-間質(zhì)損傷卻常常相對較輕，MN患者腎小管-間質(zhì)損傷相對于FSGS輕而相對于MCD重。我們推測腎病綜合征患者腎小管上皮細胞megalin表達下降與腎小管損傷存在內(nèi)在的聯(lián)系，值得進一步研究。

為何MN患者和FGSG患者腎小管腎小管megalin表達減少呢？目前尚未明確，但有研究者發(fā)現(xiàn)：1型糖尿病腎病患者在出現(xiàn)白蛋白尿的同時，尿中megalin及cubilin排泌量較正常人及未出現(xiàn)蛋白尿的糖尿病患者明顯增加[13]，提示megalin 從尿中丟失可能是引起MN和FGSG患者腎小管上皮細胞megalin下降的原因之一，是否同時由于腎小管上皮細胞megalin合成減少，需要進一步研究。緊接的問題：什么機制導致腎小管上皮細胞megalin丟失或者是合成減少呢，目前未見相關(guān)文獻報道。但我們晚近研究發(fā)現(xiàn)：FSGS尿蛋白對腎小管上皮細胞的毒性最強，MN次之，而MCD患者尿蛋白對腎小管上皮細胞的毒性作用卻非常微弱[14]，Wen等也有類似報道[15]。因此，我們推測，較為嚴重腎小球損傷導致腎小管毒性作用較強的尿蛋白成分如轉(zhuǎn)鐵蛋白和免疫球蛋白的滲漏導致了腎小管刷狀緣損傷而引起megalin從尿中丟失，或者導致腎小管上皮細胞megalin合成減少而導致了腎小管上皮細胞megalin表達減少，究竟由以上哪個因素引起，還是兩個因素共同參與，下一步的工作可以通過對不同病理類型腎病綜合征患者尿megalin排出量進行檢測，可望進一步明確。綜上所述，結(jié)合我們前期的研究結(jié)果[14,16,17]，我們推測不同病理類型腎病綜合征患者腎小管上皮細胞megalin表達差異可能由于腎小球損害所漏出的蛋白性質(zhì)不同而導致對腎小管損傷程度不同所致。

Megalin表達異?？赡芤彩悄I病綜合征患者蛋白尿形成的重要機制之一。一方面，已有研究發(fā)現(xiàn)：在大鼠或狗敲除megalin后，蛋白尿排泌量明顯增加[11,18,19]；另一方面，有學者在早期I型糖尿病腎病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞megalin表達減低的同時伴有上皮細胞內(nèi)吞蛋白減少[20]，提示疾病本身或繼發(fā)因素引起的腎小管上皮細胞功能改變可能通過影響megalin功能而參與蛋白尿的發(fā)生。

綜上所述，本研究提示，F(xiàn)SGS等病理類型腎病綜合征患者由于滲漏進入腎小管的尿蛋白毒性較強，導致腎小管損傷，從而導致腎小管上皮細胞megalin表達減少，而腎小管上皮細胞megalin表達減少又反過來加劇尿蛋白的重吸收障礙，這又反過來加重患者蛋白尿嚴重程度，針對megalin展開更加深入研究將可能對進一步明確某些病理類型腎病綜合征患者腎小管損傷機制和蛋白尿形成機制具有價值，并可能提為腎病綜合征的治療提供新的靶點。

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摘要：目的檢測成人不同病理類型腎病綜合征患者腎小管Megalin表達的差異，進一步探討腎病綜合征患者蛋白尿形成和腎小管損傷的發(fā)生機制。方法選取我院確診為原發(fā)性腎病綜合征患者62例，按照腎臟病理分為微小病變組(MCD)、膜性腎病組(MN)、局灶節(jié)段硬化組(FSGS)。收集各病例組臨床資料以及血清、尿液等臨床指標，包括患者病程、起效時間、ALB、BUN、Scr、CH、TG、HB、24小時尿蛋白定量等；應用免疫組織化學方法檢測各病例組腎小管megalm的表達；各病例組行腎臟病理常規(guī)染色，并根據(jù)腎小管損傷標準進行腎小管-間質(zhì)損傷程度評分。分析腎小管megalin表達量與臨床和病理指標的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果MCD組腎小管megalin表達量與對照組比較無統(tǒng)計學差異，而MN組、FSGS組腎小管megalin表達均顯著低于MCD組和對照組，以FSGS組降低最為顯著。各病理類型亞組腎小管megalin的表達水平與臨床指標無顯著相關(guān)關(guān)系。全組腎病綜合征、MCD亞組、MN亞組megalin的表達水平均與腎小管損傷評分存在負相關(guān)關(guān)系。結(jié)論某些病理類型腎病綜合征患者腎小管megalin表達降低可能與蛋白尿毒性有關(guān)，megalin表達的下降反過來可能參與這些患者的尿蛋白形成。

關(guān)鍵詞：腎病綜合征；腎小管；小管損傷；Megalin

Expression of megalin on renal tubule in adult patients with nephrotic syndromeHUANGFUChang-mei1,WANGLi-shu2,LIShang-mei2,etal.(1.FirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China; 2.InstituteofNephrology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China)

Abstract:ObjectiveExpression of megalin on renal tubule in different pathological types of nephrotic syndrome patients were detected,to explore the possible mechanisms of proteinuria and renal tubule injury.Methods62 primary nephrotic syndrome patients were selected and divided into minimal change disease,membranous nephropathy group and focal segmental sclerosis.Clinical indicators were collected,including duration of patients,onset time,serum albumin,blood urea nitrogen,serum creatinine,cholesterol,triglycerides,hemoglobin,and 24-hour urinary protein.Immunohistochemistry was used to detect the megalin expression on renal tubule of each group.Renal pathology was stained by HE,PASM,and Masson staining,then the renal tubule injury scores were tested according to the the tubular injury standards.ResultsThe results of semi-quantitative analysis showed that the expression of megalin on proximal tubule between the MCD group and control group has no significant difference,the expression of megalin in the MN group and FSGS group was significantly lower than in the MCD group,the expression of megalin in the FSGS group was significantly lower than in the MN group.There were no correlation between megalin expression in proximal tubule and clinical indicators in various pathological subgroups.Negative correlations between megalin expressions and renal tubule injury scores in the whole group,MCD group,MN group were found.ConclusionThe decreasing expressions of megalin on proximal tubule in patients with heavier pathological types of nephrotic syndrome were in relation with the toxicity of urine protein,and this decreasing of megalin expression then contribute to formation of proteinuria.

Key words:Nephrotic syndrome;tubular;tubule injury;Megalin

收稿日期：(2014-06-11)

作者簡介：皇甫長梅，女，在讀博士研究生，副主任醫(yī)師；王麗姝，女，在讀碩士研究生;劉華鋒(1969-)，男，教授，博士生導師，主要從事免疫性腎小球疾病發(fā)病機制方面的研究.

文獻標識碼：A

中圖分類號：R392

文章編號：1007-4287(2015)04-0557-05

通訊作者*皇甫長梅、王麗姝共同為第一作者

基金項目：國家自然科學基金(30971370/C140405)