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Whirlin與不和actin微絲相偶聯(lián)的espin存在相互作用

王樂1,郝繼龍1,韋博2*,唐麗萍3

(1.吉林大學第一醫(yī)院 眼科，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 長春130033；

3.吉林匯鋒眼科醫(yī)院 眼科，吉林 長春130000)

Usher 綜合征是一種以視力下降和聽力漸進受損最終耳聾為主的一種綜合征[1-3]。臨床上共分為三種類型，其中Usher 綜合征II型最為常見。視力受損主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜感光細胞受損后導致視網(wǎng)膜色素變性，視野逐漸變小，聽力受損主要表現(xiàn)各種不同程度的聽力喪失。眾所周知，whirlin,espin,vlgr-1這三個蛋白是組成USH2蛋白復合體的支架蛋白，任何一個蛋白的缺失都會導致USH2疾病的發(fā)生[4-6]。Espin是目前被發(fā)現(xiàn)USH2蛋白復合體里的一個新成員，并證實與whirlin存在相互作用，但至于whirlin與espin如何相互作用及相互作用的條件仍不是很清楚。

1資料與方法

1.1儀器和試劑細胞培養(yǎng)6孔板、水浴箱、低溫超速離心機、-80°冰箱、超聲處理器、電泳儀、倒置熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡。一抗購于Santa Cruz生物技術(shù)公司，蛋白G購于Amersham Biosciences公司。

1.2　實驗方法及步驟

1.2.1細胞培養(yǎng)用含有5%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)體外細胞(COS-7細胞和HEK293細胞)。將細胞均勻懸于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中并平鋪培養(yǎng)皿上，24 h后用TurboFect體外轉(zhuǎn)染試劑進行瞬間轉(zhuǎn)染，具體如下：用0.4 μg的質(zhì)粒稀釋在25 μl不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液中，混勻后，將轉(zhuǎn)染試劑加入培養(yǎng)基中，再與稀釋的質(zhì)粒培養(yǎng)液混合，室溫放置15 min，然后孵育10 h，至于倒置顯微鏡下觀察。

1.2.2體外細胞免疫共沉淀和western blotting將有目的蛋白表達的HEK293細胞中，加入裂解液并進行研磨。離心后將上清液中加入蛋白 G搖晃孵育。離心后取上清液，加入一抗搖晃3.5 h，再離心后取的上清液中加入蛋白 G sepharose,搖晃1.5 h。短暫離心后,洗沉淀物4次，再煮沸10 min。Cytochalasin D處理組，是在細胞覆蓋率達到80%后，加入4.5μM cytochalasin D/DMEM/5%FBS培養(yǎng)液中室溫孵育2h。DMSO(1∶500)處理DMEM/5%FBS里的細胞作為對照組。將所得蛋白進行western blotting,過程如下：用SDS-PAGE膠分離目的蛋白，并提純后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。經(jīng)過10%脫脂牛奶封閉蛋白1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗4℃孵育1 h，最終觀察蛋白條帶。

1.2.3熒光染色和共定位分析將細胞放于-80℃冰箱20 min，用再放入5%山羊血清/(Goat Serum,GS)PBS孵育2 h,一抗4℃孵育過夜，用PBS洗10 min，共6次。加入相應二抗/5%GS/ PBS均勻搖晃1 h。共聚焦顯微鏡下觀察并截取目的區(qū)域。

2結(jié)果

2.1Whirlin與不和actin偶聯(lián)的espin相作用在GFP-actin和espin共轉(zhuǎn)染的細胞里，espin和actin微絲共定位，espin與肌動蛋白束偶聯(lián)在一起，說明espin的纖維結(jié)構(gòu)是肌動蛋白束,(圖1)。在espin、actin和whirlin共同轉(zhuǎn)染的細胞里,espin的纖維結(jié)構(gòu)仍與actin共定位，但在這些espin/actin微絲里，whirlin表現(xiàn)出不強的信號(圖2)。表明當espin和actin微絲結(jié)合成束時，whirlin不能與espin有相互作用。眾所周知，Cytochalasin D是能夠結(jié)合肌動蛋白微絲，但是同時又抑制肌動蛋白聚合成束的一種藥物[7]。最新的研究表明，它對肌動蛋白微絲的拆卸和聚合非常有效。我們把cytochalasin D加入細胞,發(fā)現(xiàn)肌動蛋白束被大量破壞，間接釋放了大量espin蛋白。從我們實驗的結(jié)果中看，用GFP標記espin的蛋白量在免疫沉淀物中增加了4倍。(比較圖3上面和圖3下面)。這個結(jié)果與體外細胞共定位的結(jié)果一致(圖1和圖2)。從而證實當espin與actin微絲不結(jié)合成束的時候，whirlin和espin存在相互作用。

圖1在GFP-actin和espin共轉(zhuǎn)染的細胞，espin和肌動蛋白微絲共定位

圖2　在whirlin,actin和espin共同轉(zhuǎn)染的細胞，whirlin與espin/肌動蛋白微絲極少共定位

2.2　whirlin與actin無相互作用

既然whirlin和espin存在相互作用，而espin又和actin微絲相偶聯(lián)，那么，whirlin與actin之間有直接作用嗎？在whirlin和espin共轉(zhuǎn)染的細胞里，從免疫共沉淀的結(jié)果看，whirlin抗體能沉淀下來espin。但是無論我們用Cytochalasin D處理還是不用Cytochalasin D處理細胞，始終沒有發(fā)現(xiàn)whirlin和actin之間有相互作用(圖4)。

在whirlin和GFP-espin轉(zhuǎn)染的細胞里，未經(jīng)過Cytochalasin D處理的對照組(圖3上面)和經(jīng)過Cytochalasin D處理的治療組(圖3下面)相比,espin蛋白強度顯著增加。圖3　經(jīng)過Cytochalasin D處理，whirlin與espin之間　的蛋白相互作用強度顯著增加

圖4　在GFP標記espin 轉(zhuǎn)染的HEK293細胞里，actin　和GFP-espin相互作用

3討論

我們用一系列實驗證實了whirlin和espin之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)他們之間相互作用是很微弱。而Espin和actin微絲/單體又是非常高的親和力[8]。從實驗結(jié)果來看，用cytochalasin D處理過的細胞，大約也只有1-1.5%的GFP-espin蛋白存在whirlin沉淀物中(圖3)，這個微弱的相互作用主要是因為whirlin只與不和actin微絲偶聯(lián)的espin相互作用(圖2，圖3)。最終，在espin蛋白與actin蛋白中，二者不結(jié)合的蛋白非常少(這里主要指actin單體)，而在這些少量的蛋白才和whirlin蛋白存在相互親和力，導致whirlin和espin這種弱的相互作用。

參考文獻：

[1]Hartong DT,Berson EL,Dryja TP.Retinitis pigmentosa.[J].Lancet,2006,368(9549):1795.

[2]Boughman JA,Vernon M,Shaver KA.Usher syndrome:definition and estimate of prevalence from two high-risk populations.[J].J Chronic Dis，1983,36(8):595.

[3]Keats BJ,Corey DP.The usher syndromes.[J].Am J Med Genet,1999,89(3):158.

[4]Reiners J,Nagel-Wolfrum K,Jurgens K,et al.Molecular basis of human Usher syndrome:deciphering the meshes of the Usher protein network provides insights into the pathomechanisms of the Usher disease.[J].Exp Eye Res,2006,83(1):97.

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[6]Williams DS .Usher syndrome:animal models,retinal function of Usher proteins,and prospects for gene therapy.[J].Vision Res .2008,48(3):433.

[7]Yahara I,Harada F,Sekita S,et al.Correlation between effects of 24 different cytochalasins on cellular structures and cellular events and those on actin in vitro.[J].J Cell Biol,1982,92(1):69.

[8]Sekerkova G,Zheng L,Loomis PA,et al.Espins and the actin cytoskeleton of hair cell stereocilia and sensory cell microvilli.[J].Cell Mol Life Sci,2006,63(19):2329.

(收稿日期：2015-04-10)

文章編號：1007-4287(2015)07-1052-03

*通訊作者

基金項目：國家自然青年科學基金項目(81400404)；吉林省科技發(fā)展計劃資助項目(20140520034JH)；吉林大學白求恩青年科研基金項目(2013205030)