甲狀腺癌患者血漿miR-221的表達及臨床意義

徐升強

(武漢市第一醫(yī)院 檢驗科,湖北 武漢430022)

本研究擬定量檢測乳頭狀甲狀腺癌患者外周血中miR-221水平，分析其作為乳頭狀甲狀腺癌生物標志物的可行性。

1材料和方法

1.1標本采集

實驗共收集本院住院部53例乳頭狀甲狀腺癌患者，33例甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者，另外50例排除各種腫瘤的健康志愿者用于對照。所有納入研究的個體都簽署了知情同意書，經(jīng)本院倫理委員會批準。乳頭狀甲狀腺癌和甲狀腺良性結(jié)節(jié)均經(jīng)由病理切片診斷。乳頭狀甲狀腺癌患者男5例，女48例，平均年齡38.6±6.9歲。甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者男6例、女27例，平均年齡40.2±7.3歲。健康對照組男15例，女35例，平均年齡37.4±8.2歲。清晨采集患者外周血2 ml，EDTA抗凝，3 000 g離心5 min，上清微量離心管再次12 000 g離心10 min，上清保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｋ袠吮静杉? h內(nèi)處理完畢。

1.2MiRNA提取

采用miRcute miRNA提取試劑盒(天根生物技術(shù)公司，北京)按照說明書進行抽提血漿miRNA。400 μl血漿與等量的變性液混勻后加入5 μl合成的cel-miR-39(5fmol/μl)。Cel-miR-39被用于操作過程中的內(nèi)參。最后用30 μl無RNA酶的水溶解miRNA。

1.3逆轉(zhuǎn)錄

用miRcute miRNA 單鏈cDNA合成試劑盒(天根生物技術(shù)公司，北京)合成miRNA的cDNA。加A反應(yīng)在20 μl體系中進行：11.6 μl無RNA酶ddH2O，2 μl 10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.4 μl Poly(A)聚合酶(5 U/μl)，4 μl 5×rATP溶液，2 μl miRNA?；靹蚝?7℃反應(yīng)60 min。取2 μl反應(yīng)物用于逆轉(zhuǎn)錄，其余保存于-80℃。逆轉(zhuǎn)錄同樣在20 μl體系中進行：11.5 μl 無RNA酶的ddH2O，1 μl RNasin(40 U/μl)，2 μl 10×RT緩沖液，2 μl 10×RT引物，1 μl dNTP混合物(每種2.5 mM)，0.5 μl Quant RTase，2 μl Poly(A)反應(yīng)產(chǎn)物?；靹蚝?7℃反應(yīng)60 min。合成的cDNA保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4定量RT-PCR分析

在20 μl體系中進行qRT-PCR反應(yīng)：7.2 μl ddH2O，10 μl 2×miRcute miRNA 預(yù)混液(含SYBR和ROX)，0.4 μl逆轉(zhuǎn)錄引物(10 μM)，0.4 μl前向引物(10 μM)，2 μl cDNA?；旌衔锉痪譃閮煞?。反應(yīng)條件為：94℃ 2 min預(yù)變性后，40個循環(huán)于94℃ 2 s，60攝氏度34 s。反應(yīng)在ABI step-one儀器上進行，儀器自動設(shè)定循環(huán)閾值(Ct)。miR-221的特異引物： GGGAGCTACATTGTCTGCTGGTTTC； U6b特異引物：ACGCAAATTCGTGAAGCGTT，cel-miR-39特異引物:CACCGGGTGTAAATCAGCTTG。B6b和cel-miR-39被用作內(nèi)參。根據(jù)Tomasetti’s的描述，ΔCTmiR-221=CTmiR-221-CTU6b-CTcel-miR39，ΔCTmiR-221越高miR-221水平越低。SLE患者較正常對照miR-221的相對表達水平以2-ΔΔCT表示。每個定量反應(yīng)設(shè)置復(fù)孔，結(jié)果取均值。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

miR-221的表達方式為均值±SD。通過Wilcoxon秩和檢驗對兩組間均值進行比較。受試者工作曲線(ROC)分析診斷效率。P<0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。所有的統(tǒng)計分析采用SPSS13.0軟件進行。

2結(jié)果

2.1miR-221在各研究組中的水平

乳頭狀甲狀腺癌患者組miR-221水平顯著高于正常對照組[-31.31±3.10 (95%CI:-30.28--32.34,P=0.035) versus -29.33±3.23(95%CI:-28.55—30.67),P=0.038]。乳頭狀甲狀腺癌患者組miR-221平均水平約為正常對照組的3.71倍。乳頭狀甲狀腺癌患者miR-221水平與甲狀腺良性結(jié)節(jié)，甲狀腺良性結(jié)節(jié)與正常對照的比較情況見圖1。

2.2miR-221在甲狀腺手術(shù)前后的水平

比較乳頭狀甲狀腺癌手術(shù)前及術(shù)后一周血漿中miR-221水平發(fā)現(xiàn)，術(shù)后患者血漿miR-221水平顯著下降[術(shù)前-31.31±3.10 (95%CI:-30.28--32.34,P=0.035) vs 術(shù)后-33.33±3.86(95%CI:-31.43—35.32),P=0.022]，手術(shù)后一周血漿miR-221水平下降約4.06倍(圖2)。

2.3miR-221對乳頭狀甲狀腺癌的診斷評價

ROC曲線下面積為0.75±0.06 (95%CI:0.63-0.88,P=0.01)(圖3)。當(dāng)miR-221檢測以ΔCT=-30.27為臨界值時，其敏感度為75.9%，特異度為62.1%。陽性預(yù)測值66.7%，陰性預(yù)測值72.0%。

圖1血漿miR-221在各研究組間的水平。 圖2乳頭狀甲狀腺癌手術(shù)前后血圖3血漿miR-221對乳頭狀甲狀腺癌

乳頭狀甲狀腺癌患者血漿miR-221漿miR-221水平。乳頭狀甲診斷作用的ROC分析

水平顯著高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)及健狀腺癌患者血漿miR-221水

康對照(P<0.05)，甲狀腺良性結(jié)節(jié)平手術(shù)后顯著下降(P<0.05)

患者與健康對照血漿miR-221水平

無顯著差異(P>0.05)

3討論

本研究中，我們通過實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測乳頭狀甲狀腺癌患者血漿循環(huán)miR-221的水平。我們發(fā)現(xiàn)與甲狀腺良性結(jié)節(jié)及健康對照者相比，乳頭狀甲狀腺癌患者血漿miR-221水平顯著增高(P<0.01)，手術(shù)后此miRNA水平顯著下降(P<0.01)。乳頭狀甲狀腺癌術(shù)后、甲狀腺良性結(jié)節(jié)及健康對照者血漿miR-221水平無顯著性差異(P>0.05)。

人miR-221定位于X染色體，其序列在各物種間高度保守。已有的研究發(fā)現(xiàn)miR-221在不同的腫瘤發(fā)病中具有不同的作用，在一些腫瘤中起抑制作用而在另一些腫瘤中則可能起刺激作用。細胞周期調(diào)劑蛋白p27 Kip1的編碼基因被認為是miR-221的一個靶點，在胰腺癌、胃癌、甲狀腺癌、乳腺癌、肝癌及肺癌細胞中， miR-221與p27 Kip1的表達呈負相關(guān)[5-7]，說明miR-221參與細胞周期的調(diào)節(jié)。miR-221在腫瘤細胞中可以同時調(diào)節(jié)多種腫瘤相關(guān)基因的表達從而達到對腫瘤發(fā)生協(xié)同刺激作用[8]。

自從發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA在外周血中可以穩(wěn)定存在，miRNA已被作為生物標志物進行廣泛的研究。miRNA作為生物標志物具有多種優(yōu)點[9]：①比mRNA穩(wěn)定。miRNA在血漿中能夠被較長時間的保存，并且對反復(fù)凍融等苛刻條件不敏感。②利于檢測。當(dāng)前對miRNA的實時定量檢測技術(shù)已經(jīng)比較成熟。較之對蛋白等生物標志物的檢測，能夠通過實時定量PCR檢測的生物標志物具有更高的診斷敏感度和特異度。③miRNA在體內(nèi)的功能十分豐富，對其進行高通量的定量分析，有利于及早全面了解機體健康狀況。多項研究已經(jīng)證實乳頭狀甲狀腺癌組織中高表達miR-221。至今尚未見到miR-221作為乳頭狀甲狀腺癌患者血漿生物標志物。本研究中，我們檢測了乳頭狀甲狀腺癌患者血漿循環(huán)miR-221水平，發(fā)現(xiàn)miR-221在乳頭狀甲狀腺癌患者血漿中高表達(P<0.01)。血漿miR-221對乳頭狀甲狀腺癌具有中等強度的診斷效能(AUC=0.75±0.06)。

總之，本研究檢測了乳頭狀甲狀腺癌患者手術(shù)前后、甲狀腺良性結(jié)節(jié)及健康人血漿miR-221水平，分析其作為乳頭狀甲狀腺癌生物標志物的特性。我們的數(shù)據(jù)提示miR-221在乳頭狀甲狀腺癌患者血漿中高表達。對乳頭狀甲狀腺癌具有中等強度的診斷效能，進一步可聯(lián)合其他乳頭狀甲狀腺癌的生物標志物來提高血漿miR-221對乳頭狀甲狀腺癌的診斷效能。

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收稿日期：(2013-11-12)

文章編號：1007-4287(2015)03-0421-03