袁兆新，高　寒，池　明，張宏宇,計國義

(1.長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長春130031；2.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 泌尿外科)

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CLIC4在饑餓誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬中的作用

袁兆新1，高寒1，池明1，張宏宇2,計國義3*

(1.長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長春130031；2.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 泌尿外科)

摘要：目的通過饑餓誘導(dǎo)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，利用siRNA技術(shù)部分沉默細(xì)胞內(nèi)氯通道蛋白4(CLIC4)，探討CLIC4在細(xì)胞自噬中的作用。方法根據(jù)CLIC4的基因序列構(gòu)建CLIC4 siRNA質(zhì)粒，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CLIC4 siRNA的U251細(xì)胞株，分析CLIC4 蛋白表達(dá)；MTT法檢測轉(zhuǎn)染pSH1Si-CLIC4對細(xì)胞生存率的影響；利用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染CLIC4 siRNA在U251細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)；檢測饑餓條件下U251細(xì)胞LC3蛋白、Bax、Bcl-2的表達(dá)；檢測抑制CLIC4表達(dá)對于饑餓條件下細(xì)胞白caspase-3和胞漿cytc以及LC3的表達(dá)。結(jié)果Western Blot顯示，與空質(zhì)粒對照組相比，轉(zhuǎn)染CLIC4 siRNA的U251細(xì)胞CLIC4表達(dá)顯著下降；與對照組相比，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞組以及瞬時轉(zhuǎn)染pSH1Si-CLIC4載體細(xì)胞組U251細(xì)胞生存率均無明顯差異；單純CLIC4 siRNA對于U251細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)無影響；與對照組相比，饑餓8 h能夠誘導(dǎo)U251細(xì)胞自噬，LC3水平顯著增加，而細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)無明顯變化；轉(zhuǎn)染CLIC4 siRNA后饑餓8 h，caspase-3、cytc以及LC3表達(dá)增加。結(jié)論單純CLIC4 siRNA對于U251細(xì)胞自噬和凋亡均無顯著影響，饑餓條件下U251細(xì)胞發(fā)生自噬的同時并沒有明顯細(xì)胞凋亡過程，抑制CLIC4表達(dá)促進(jìn)了饑餓條件下的U251細(xì)胞自噬，同時能夠啟動線粒體相關(guān)途徑的細(xì)胞凋亡。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0707)

程序性細(xì)胞死亡是多細(xì)胞動物的一種重要死亡途徑，包含了多種生物進(jìn)程如形態(tài)的形成、保持、組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等，以清除機體中有害的細(xì)胞[1]。近來研究表明，凋亡并不是PCD唯一形式，另外一種細(xì)胞死亡形式被稱為自噬性程序性細(xì)胞死亡也就是自噬[2]。由于細(xì)胞內(nèi)氯通道家族中只有CLIC4在線粒體上表達(dá)，因此也稱之線粒體細(xì)胞內(nèi)氯通道[3]。此外CLIC4在細(xì)胞核、微絲等不同的細(xì)胞器或亞結(jié)構(gòu)上均有表達(dá)[4]。有研究表明，CLIC4對于血管生成中的細(xì)胞酸化具有調(diào)節(jié)作用[3]，而細(xì)胞酸化也是自噬過程中的一個重要指標(biāo)[5]。因此我們推測，CLIC4蛋白對于維持線粒體功能和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)具有重要的意義，很可能會影響線粒體的正常生理過程，并進(jìn)而影響細(xì)胞的分化、增殖或者細(xì)胞死亡。

1材料與方法

1.1材料pSilencerTM3.1-H1 neo siRNA空載體和pSilencerTM3.1-H1 neo-Scramble siRNA購自美國Ambion公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，接種于含10%胎牛血清的DMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.3CLIC4 siRNA模板寡核苷酸設(shè)計根據(jù)GenBank上的人源的線粒體CLIC4基因序列，確定的RNA干涉靶位點。

1.4細(xì)胞生長抑制試驗-MTT 設(shè)3個陰性對照組，酶標(biāo)儀進(jìn)行比色分析。

1.5Western Blot 檢測不同實驗組別的細(xì)胞蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3、cytc和LC3表達(dá)。

2結(jié)果

2.1WesternBlot檢測轉(zhuǎn)染pSH1Si-CLIC4的U251細(xì)胞CLIC4 蛋白表達(dá)如圖1所示，轉(zhuǎn)染pSH1Si-CLIC4載體24h、48h的U251細(xì)胞，CLIC4表達(dá)與空質(zhì)粒對照組相比明顯下降(P<0.01)。

2.2MTT法檢測轉(zhuǎn)染pSH1Si-CLIC4對U251細(xì)胞生存率的影響如圖2所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染

空質(zhì)粒細(xì)胞組以及瞬時轉(zhuǎn)染pSH1Si-CLIC4載體24h和48h細(xì)胞組，U251細(xì)胞生存率均無明顯差異(P>0.05)。

**P<0.01vsemptyvector

圖2　轉(zhuǎn)染pSH1Si-CLIC4對U251細(xì)胞生存率的影響

2.3WesternBlot檢測檢測饑餓條件下U251細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)如圖3所示，與對照組相比，U251細(xì)胞饑餓后LC3-I和LC3-II表達(dá)增強(P<0.05)，并且隨著時間的延長(4h、8h、12h)LC3-II表達(dá)進(jìn)一步增加(P<0.01)。

**P<0.01versuscontrol

2.4WesternBlot檢測饑餓條件下U251細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)如圖4所示與對照組相比，U251細(xì)胞饑餓4h、8h、12h后，Bax和Bcl-2變化不明顯。

2.5WesternBlot檢測饑餓條件下抑制CLIC4對U251細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和胞漿cytc表達(dá)如圖5所示，與對照組相比，U251細(xì)胞饑餓8h后cleavedcaspase-3和cytc蛋白表達(dá)變化不明顯(P>0.05)。在轉(zhuǎn)染CLIC4siRNA后饑餓8h，cleavedcaspase-3和cytc表達(dá)增加。

2.6WesternBlot檢測饑餓條件下抑制CLIC4表達(dá)對U251細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)影響如圖6所示與對照組相比，U251細(xì)胞饑餓8h后LC3-II表達(dá)增強。與饑餓組相比，CLIC4siRNA細(xì)胞組，饑餓8h后，LC-II表達(dá)增強(P<0.05)。

圖4　饑餓條件下U251細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)

*P<0.01vsstarvationgroup

*P<0.05vscontrolgroup,**P<0.01vscontrolgroup,#P<0.05vsemptyvectorgroup

3討論

惡性膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤之一，經(jīng)典的caspase途徑細(xì)胞凋亡是被廣泛認(rèn)可的抑制腫瘤生長的最有效的方式[6]。而膠質(zhì)瘤對凋亡相關(guān)手段的治療卻十分耐受，因此對于其有效治療急需一種凋亡之外的新策略[7]。本研究探討了饑餓誘導(dǎo)的自噬中CLIC4的作用，我們通過構(gòu)建pSilencerTM3.1-H1neoCLIC4siRNA載體，部分沉默線粒體氯通道CLIC4蛋白。研究結(jié)果表明，在正常培養(yǎng)條件下，單純的CLIC4siRNA對于U251細(xì)胞自噬和凋亡均無顯著影響。饑餓條件下，U251細(xì)胞發(fā)生自噬的同時并沒有明顯的細(xì)胞凋亡過程，而沉默CLIC4后促進(jìn)了饑餓條件下的U251細(xì)胞自噬，同時能夠啟動caspase相關(guān)的線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。當(dāng)沉默CLIC4后的饑餓條件下細(xì)胞迅速上調(diào)自噬水平或許會在今后神經(jīng)膠質(zhì)瘤研究和治療中具有廣闊的前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]BerrymanMA,GoldenringJR.CLIC4isenrichedatcell-celljunctionsandcolocalizeswithAKAP350atthecentrosomeandmidbodyofculturedmammaliancells[J].CellMotilCytoskeleton,2003,56(3):159.

[2]SuhKS,MutohM,NagashimaK，etal.TheorganellularchloridechannelproteinCLIC4/mtCLICtranslocatestothenucleusinresponsetocellularstressandacceleratesapoptosis[J].JBiolChem,2004,279(6):4632.

[3]XueL,BorutaiteV,TolkovskyAM.Inhibitionofmitochondrialpermeabilitytransitionandreleaseofcytochromecbyanti-apoptoticnucleosideanalogues[J].BiochemPharmacol,2002,64(3):441.

[4]LiuB,ChengY,LiuQ，etal.Autophagicpathwaysasnewtargetsforcancerdrugdevelopment[J].ActaPharmacolSin,2010,31(9):1154.

[5]PattingreS,TassaA,QuX，etal.Bcl-2antiapoptoticproteinsinhibitBeclin1-dependentautophagy[J].Cell,2005,122(6):927.

[6]HaileyDW,RamboldAS,Satpute-KrishnanP，etal.Mitochondriasupplymembranesforautophagosomebiogenesisduringstarvation[J].Cell,2010,141(4):656.

[7]LumJJ,BauerDE,KongM，etal.Growthfactorregulationofautophagyandcellsurvivalintheabsenceofapoptosis[J].Cell,2005,120(2):237.

關(guān)鍵詞：膠質(zhì)瘤細(xì)胞；自噬；凋亡；CLIC4

The role of CLIC4 protein in autophagy induced by starvation in glioma cellsYUANZhao-xin,GAOHan，CHIMing，etal.(ChangchunMedicalCollege,Changchun130031，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the mechanism and effects of CLIC4 protein in glioma cells autophagy induced by starvation through siRNA silencing CLIC4.MethodsBased on the gene sequence,CLIC4 siRNA plasmid and stable transfected U251 cells were constructed.The level of CLIC4 expression was analyzed.To detect cell vitality,MTT method was applied.To investigate the effect of CLIC4 siRNA on the apoptosis induced by starvation，the levels of Bax，Bcl-2 were detected.To investigate the effect of CLIC4 siRNA on the apoptosis and autophagy induced by starvation，the levels of cleaved caspase-3,cytosolic cyt c and LC3 were detected.ResultsCompared with the control group,the results indicated that there was obvious decrease of CLIC4 expression in U251 cells with CLIC4 siRNA transfected.MTT results indicated that there was no obvious effect of cell vitality with CLIC4 siRNA transfected There were no obvious changes in protein Bax and Bcl-2 with CLIC4 siRNA transfected U251 cells.Compared with control group,the level of LC3 had a significant increase under starvation in U251 cells at 8 hours.Meanwhile,protein Bax,Bcl-2 had no significant change under starvation.Western Blot indicated cleaved caspase-3,cytosolic cyt c and LC3 expression increased in CLIC4 siRNA transfected U251 cells under starvation.ConclusionThe results showed that CLIC4 siRNA had no effect on cell autophagy and apoptosis.Under starvation,autophagy was detected in U251 cells but no apoptosis.CLIC4 siRNA enhanced the autophagy under starvation,on the same time,triggered caspase-dependent mitochondrial apoptosis.

Key words:Glioma cells，autophagy，apoptosis，CLIC4

(收稿日期：2014-06-08)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R363.2

文章編號：1007-4287(2015)05-0707-04

*通訊作者

基金項目:吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目(吉教科文合字2011第363號)