張慧娟，朱瑾英，劉德平，劉丹丹，曹鴻雁，于莉薇，俞秋霞

(1．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，黑龍江 哈爾濱150001； 2．北京市第六人民醫(yī)院，北京100007；

3．哈爾濱市穆斯林醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001)

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厄貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟chemerin表達(dá)的影響

張慧娟1，朱瑾英2，劉德平3，劉丹丹1，曹鴻雁1，于莉薇1，俞秋霞1

(1．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，黑龍江 哈爾濱150001； 2．北京市第六人民醫(yī)院，北京100007；

3．哈爾濱市穆斯林醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001)

摘要：目的探討血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑厄貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟chemerin的影響。方法將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病組和厄貝沙坦治療組，以鏈脲佐菌素(STZ)及高糖高脂飲食制備2型糖尿病大鼠模型，給予厄貝沙坦40 mg/(kg·d)治療8 周后處死大鼠。 Western blot檢測(cè)各組腎組織chemerin蛋白的表達(dá)。應(yīng)用放射免疫法檢測(cè)血清血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的含量。結(jié)果與對(duì)照組相比，糖尿病組血肌酐、尿素氮、24小時(shí)尿白蛋白排泄率及AngⅡ水平均顯著升高(P<0.05)，厄貝沙坦治療后血肌酐及24小時(shí)尿白蛋白排泄率較糖尿病組顯著降低(P<0.05)。糖尿病組大鼠腎組織中chemerin蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，治療組表達(dá)水平明顯下降。結(jié)論chemerin在糖尿病大鼠腎臟中表達(dá)增加，厄貝沙坦可能通過(guò)抑制RAS系統(tǒng)降低chemerin的表達(dá)，從而對(duì)腎臟起保護(hù)作用。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0697)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，也是終末期腎衰竭的主要病因，而其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。有研究表明，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS) 的過(guò)度激活是糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的重要因素[1]。厄貝沙坦為血管緊張素Ⅱ受體1 拮抗劑(AngiotensinⅡ receptor 1 antagonism，AT1RA)，通過(guò)阻斷AngⅡ與其受體結(jié)合，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。細(xì)胞因子chemerin是一種具有促炎癥細(xì)胞聚集的趨化因子，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，參與胰島素抵抗以及慢性炎癥反應(yīng)，它在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的研究鮮有報(bào)道。本研究擬觀察厄貝沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟chemerin表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療糖尿病腎病提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1．1試劑厄貝沙坦(irbesartan，杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，兔抗鼠chemerin單克隆抗體(Santa Cruz公司)，二抗(北京中山技術(shù)有限公司)，AngⅡ放免試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)。

1．2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和動(dòng)物分組30只10周齡SD大鼠，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，每組10只，隨機(jī)抽取1組做為空白對(duì)照組(A組10只，普通飲食喂養(yǎng))，剩余2組大鼠采用高糖高脂飲食喂養(yǎng)6周后，給予腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，劑量為35 mg/kg)制備2型糖尿病大鼠模型，對(duì)照組只注射相同體積的枸櫞酸緩沖液。48 h后測(cè)定血糖、尿糖，血糖≥16.7 mmol/L且尿糖+++-++++確定為糖尿病大鼠模型。將成模的20只糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病組(B組10只)和糖尿病厄貝沙坦干預(yù)組(C組10只)。其中，A、B組大鼠分別給予等體積生理鹽水，C組大鼠給予厄貝沙坦灌胃(40 mg/kg.d-1)連續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲食，不使用胰島素及其它降糖藥物。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中糖尿病組及干預(yù)組各死亡大鼠兩只。

1．3標(biāo)本收集厄貝沙坦灌胃8周后，于大鼠處死前1天用代謝籠留取尿標(biāo)本，用于測(cè)定24 h尿白蛋白排泄率。大鼠禁食12 h候后，用20%烏拉坦按1.35 g/kg腹腔注射麻醉大鼠，心臟采血留取血標(biāo)本，用于測(cè)定AngⅡ、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)。大鼠處死后迅速取出腎臟，經(jīng)反復(fù)灌洗后放入-80℃冰箱保存，用于western blot檢測(cè)。

1．4生化學(xué)指標(biāo)測(cè)定空腹血糖(FBG)采用強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀測(cè)定。甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)采用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行測(cè)定。24 h尿蛋白排泄率采用免疫法測(cè)定。血管緊張素Ⅱ采用放射免疫法測(cè)定。

1．5western blot 檢測(cè)腎臟chemerin蛋白表達(dá)取出冰凍腎小球，加入組織蛋白裂解液，超聲碎裂后提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度。取50 μg樣本蛋白，加樣本處理液，煮沸5 min，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳。2 h后轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，加入chemerin抗體(1∶1 000)，4℃過(guò)夜，TBST洗膜3×10 min，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3×10 min，ECL發(fā)光劑顯色并曝光成像。

1．6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩組比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1各組生化學(xué)指標(biāo)的變化與對(duì)照組相比，糖尿病組及治療組大鼠血糖、總膽固醇、甘油三酯水平明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后大鼠血糖下降(P<0.05)，見表1。與對(duì)照組相比，糖尿病組及治療組大鼠血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白排泄率及AngⅡ水平明顯升高(P<0.05)。治療后大鼠血肌酐及24 h尿蛋白排泄率水平下降(P<0.05)，見表2。

2．2Western blot結(jié)果糖尿病組大鼠腎組織中chemerin蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，經(jīng)厄貝沙坦灌胃治療后，其表達(dá)水平明顯下降，見圖1。

表1　各組大鼠血糖、血脂比較

與對(duì)照組相比*P<0.05，與糖尿病組相比#P<0.05

表2　各組大鼠尿素氮、肌酐、尿白蛋白及AngⅡ比較

與對(duì)照組相比*P<0.05，與糖尿病組相比#P<0.05

圖1　各組大鼠腎組織chemerin蛋白表達(dá)

3討論

脂肪因子chemerin也稱作視黃酸受體反應(yīng)蛋白2(retinoic acid receptor responder 2，RARRES2)，人類chemerin基因定位于7q36.1，mRNA 長(zhǎng)度為734 bp，Chemerin蛋白分子量為18 ku，由163個(gè)氨基酸組成，在人類中以前蛋白的形式存在，經(jīng)蛋白水解酶水解活化后表現(xiàn)生物活性。Chemerin可由脂肪細(xì)胞分泌，通過(guò)自分泌途徑作用于自身受體CMKLRl，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，并可通過(guò)旁分泌途徑作用于炎性反應(yīng)細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)，參與免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)[2,3]。目前有關(guān)于chemerin與糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制也越來(lái)越受到人們的重視。研究顯示，慢性腎透析病人血清chemerin水平約是對(duì)照組的2倍，同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和慢性腎透析組的GFR與血清chemerin水平呈顯著負(fù)相關(guān)[4]。Rutkowski等[5]證實(shí)末期腎臟病患者腎移植后血清chemerin濃度呈下降趨勢(shì)，血清chemerin水平與腎功能水平呈獨(dú)立相關(guān)，提示chemerin水平可反映腎臟炎癥程度。有研究發(fā)現(xiàn)與健康受試者、2型糖尿病未合并蛋白尿患者相比，2型糖尿病伴大量蛋白尿患者的血清chemerin 水平明顯升高[6]，并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)chemerin及其受體chemR23在糖尿病大鼠腎臟中表達(dá)增加，且chemerin的表達(dá)水平與腎臟炎癥反應(yīng)因子及腎小球細(xì)胞成纖維化因子如TGF-β1、TNF-α呈顯著相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎臟chemerin蛋白表達(dá)升高，與既往研究一致，提示chemerin與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)RAS系統(tǒng)中的AngⅡ促使系膜增殖、肥大及基質(zhì)分泌增加，引起系膜區(qū)擴(kuò)張和系膜細(xì)胞收縮，從而增加濾過(guò)膜的通透性，最終產(chǎn)生蛋白尿[8]。而厄貝沙坦作為一種選擇性AngⅡ受體AT1拮抗劑，它能完全阻斷由AT1介導(dǎo)的血管緊張素II的全部活性，通過(guò)降低腎小球灌注壓，增加腎血流量，減少尿蛋白濾過(guò)。同時(shí)，厄貝沙坦還能通過(guò)抑制腎臟系膜細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，降低TGF-β1，改善腎間質(zhì)纖維化，從而延緩腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展[9,10]。新近John等的研究表明，ACE參與chemerin肽鏈C端的剪切，且此作用可被ACE抑制劑卡托普利所抑制[11]。Hoppmann等的研究證實(shí)，選擇性鹽皮質(zhì)激素受體激動(dòng)劑醛固酮可促進(jìn)小鼠白色脂肪組織中chemerin的表達(dá)[12]。上述研究提示RAS系統(tǒng)在糖尿病腎病中的作用可能與chemerin的生物學(xué)效應(yīng)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，給予厄貝沙坦治療8周后，糖尿病大鼠24 h尿蛋白排泄率及肌酐均較對(duì)照組有明顯的改善，說(shuō)明其對(duì)腎臟有保護(hù)作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，腎臟中chemerin的表達(dá)水平也顯著下降，提示chemerin的促糖尿病腎病作用可能與RAS的過(guò)度激活有關(guān)。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)chemerin在糖尿病大鼠腎臟中表達(dá)顯著增加，厄貝沙坦降低腎臟中chemerin的表達(dá)，可能與抑制RAS系統(tǒng)有關(guān)。

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關(guān)鍵詞：2型糖尿??；腎臟；chemerin；RAS系統(tǒng)；厄貝沙坦

Effect of irbesartan on chemerin in the renal tissues of diabetic ratsZHANGHui-juan，ZHUJin-ying，LIUDe-ping，etal.(DepartmentofEndocrinology,FirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of renin-angiotensin system (RAS) on the expression of chemerin in streptozotocin-induced diabetic rats.MethodsAfter 6-week feeding with high-fat and high-carbohydrate diet,rats were administrated with STZ and randomized to control,diabetic,irbesartan-treated groups.The chemerin protein was identified by western blot.The level of angiotensin II (AngⅡ ) was measured by radioimmunoassay．ResultsBlood urea nitrogen (BUN),serum creatinine (Scr),urinary albumin excretion rate(UAER) and AngⅡ levels in diabetic group were much higher than that in the control group.The level of chemerin in the renal tissues was significantly elevated in the diabetic group compared with the control group.Eight weeks after Irbesartan treatment,the Scr,UAER and chemerin were significant decreased.ConclusionIrbesartan treatment ameliorate renal function through an inhibitory effect on the activation of intrarenal RAS,which may impact chemerin expression levels in the kidney of diabetic rats.

Key words:type 2 diabetes；kidney；Chemerin；renin-angiotensin system；Irbesartan

(收稿日期：2014-07-13)

作者簡(jiǎn)介：張慧娟，女，42歲，博士，副主任醫(yī)師，副主任，研究方向：糖尿病慢性合并癥病發(fā)病機(jī)制。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R587

文章編號(hào)：1007-4287(2015)05-0697-03

基金項(xiàng)目:黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助(編號(hào)：12531233)