馬永達(dá)，王旭輝，陳 強(qiáng)

1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所麻醉科，重慶 400042;2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所神經(jīng)外科，重慶 400042

交通事故傷所造成的創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)已經(jīng)成為青年人致殘和死亡的主要原因。腦損傷的預(yù)防和傷后救治成為一個亟待解決的問題。TBI的病理機(jī)制是一個復(fù)雜的、多重因素相互重疊、共同作用的過程。膜通透性增加、自由基損傷、興奮性氨基酸中毒、缺血及再灌注損傷等都參與其中，而神經(jīng)元胞內(nèi)鈣超載是上述所有致傷因素的共同通路。因此，研究創(chuàng)傷后神經(jīng)元胞內(nèi)鈣代謝的變化規(guī)律，對于保護(hù)神經(jīng)元功能、改善TBI的救治效果具有重要意義。筆者對糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)調(diào)節(jié)創(chuàng)傷后神經(jīng)元胞膜鈣泵的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 GC在TBI后腦保護(hù)中運(yùn)用

GC由于其強(qiáng)大的抗炎、抗氧化、穩(wěn)定生物膜等作用，一直被用于治療TBI［1］，但其作用機(jī)制沒有闡明。研究發(fā)現(xiàn)，GC可以通過不同的作用方式對神經(jīng)元起到保護(hù)作用，如GC可以直接激活生長因子受體，并引發(fā)相關(guān)效應(yīng)，起到神經(jīng)保護(hù)作用［2-3］;促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)性物質(zhì)，如精氨酸和還原型谷胱甘肽的合成［4］;上調(diào) Bcl-2、Bcl-x等保護(hù)性因子，增強(qiáng)神經(jīng)元對抗神經(jīng)毒素的能力［5］;抗炎、抗氧化;激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路(3-Akt-kinase通路)等機(jī)制，避免TBI后神經(jīng)元的死亡，從而對神經(jīng)元起到保護(hù)作用［6］。另外，GC調(diào)節(jié)神經(jīng)元胞內(nèi)鈣代謝水平狀況，是發(fā)揮保護(hù)作用的重要途徑之一。因此，GC對生物體作用是廣泛而復(fù)雜的，只有在更加詳細(xì)地了解其錯綜復(fù)雜機(jī)制的基礎(chǔ)上，才能在不同疾病的不同階段正確使用，從而最大程度發(fā)揮其保護(hù)作用。

2 胞內(nèi)鈣超載是TBI后神經(jīng)元發(fā)生損傷和凋亡的共同通路

細(xì)胞內(nèi)的鈣超載和平衡失調(diào)是TBI后短期內(nèi)神經(jīng)元壞死和凋亡的重要原因［2］，并可能與TBI后長期神經(jīng)功能障礙(如突觸可塑性和學(xué)習(xí)、記憶［7］)和對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病易感性增加有關(guān)［8］。既往研究曾從控制鈣內(nèi)流系統(tǒng)(主要為各種鈣通道)入手改善TBI后神經(jīng)元內(nèi)鈣離子失衡。研究顯示，L型鈣通道阻滯藥可以在損傷后保護(hù)神經(jīng)元，并且臨床研究顯示可以減少不良預(yù)后［1］。證明阻滯細(xì)胞鈣離子的大量內(nèi)流，是減少神經(jīng)元鈣超載，保護(hù)神經(jīng)元免于死亡的途徑之一。已有研究表明，鈣清除系統(tǒng)(包括細(xì)胞膜鈣泵、膜鈉鈣交換體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵和線粒體鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體)在細(xì)胞的損傷乃至死亡過程中同樣占有重要地位，是細(xì)胞損傷及凋亡的共同通路之一［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡的過程中，細(xì)胞膜上重要的鈣清除分子—細(xì)胞膜鈣泵(plasma membrane Ca2+ATPase，PMCA)作為capase-3的底物被裂解［10］;興奮性氨基酸中毒的損傷過程中，胞膜鈣泵和胞膜的鈉-鈣交換體(Na-Ca exchange，NCX)可被某些蛋白酶分解，從而進(jìn)一步削弱細(xì)胞維持胞漿鈣離子平衡的能力，形成鈣超載，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;而阻斷PMCA和NCX的裂解則可以減少興奮性毒素所導(dǎo)致的凋亡［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，某些神經(jīng)保護(hù)因子可以通過調(diào)整PMCA的活性，實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)元保護(hù)作用［6，12］，表明神經(jīng)元損傷后，鈣清除系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)也是防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)而防止細(xì)胞死亡的重要因素。因此，降低 TBI后神經(jīng)元胞內(nèi)鈣超載是保護(hù)神經(jīng)元的重要措施之一。

3 GC調(diào)節(jié)TBI后神經(jīng)元胞內(nèi)鈣超載的途徑

Chen等［13］研究證實(shí)，GC可以降低創(chuàng)傷后神經(jīng)元胞內(nèi)鈣超載的水平，這是GC發(fā)揮保護(hù)作用的重要途徑之一。研究提示，阻斷創(chuàng)傷后神經(jīng)元鈣超載這一共同通路，有可能改善創(chuàng)傷性神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。

通常參與神經(jīng)元胞內(nèi)鈣代謝的途徑有PMCA、NCX、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵(sarcoplasnic reticulum Ca2+ATPase，SERCA)和線粒體鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體。有研究提示，GC可以調(diào)節(jié)創(chuàng)傷后神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的鈣超載，主要表現(xiàn)為GC可以抑制某些神經(jīng)遞質(zhì)引發(fā)的鈣內(nèi)流，還可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵［14］，防止胞質(zhì)內(nèi)鈣離子過度升高;而在調(diào)節(jié)創(chuàng)傷后神經(jīng)元胞內(nèi)鈣代謝時，GC是否具有主動將胞內(nèi)超載的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外的能力，避免創(chuàng)傷后神經(jīng)元胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)而防止神經(jīng)元細(xì)胞凋亡或死亡，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能的作用，但其相關(guān)報道較少，因此有必要對其進(jìn)行深入的研究。

4 GC在介導(dǎo)PMCA減輕神經(jīng)元胞內(nèi)鈣超載中的作用

為了探討GC通過介導(dǎo)PMCA對神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)鈣瞬變的影響，Chen等［13］在前期分別用1×10-6、1×10-9mol/L的地塞米松(DEX)作用于神經(jīng)元。為了最大限度地減少細(xì)胞外鈣離子對觀察結(jié)果的影響，Chen等［13］設(shè)計(jì)了細(xì)胞外無鈣的觀察條件。研究發(fā)現(xiàn)，1×10-6mol/L DEX能夠激活PMCA，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速下降，而1×10-9mol/L的DEX沒有這種生物效應(yīng);使用KB-R7943和毒胡蘿卜素(thapsigargin)阻滯NCX和SERCA不能影響這種效應(yīng)，但是用pH值8.8的細(xì)胞外液阻斷PMCA后，則完全阻滯了DEX所導(dǎo)致的鈣下降現(xiàn)象。提示GC導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速下降的原因在于激活PMCA，而與NCX和SERCA的活性變化沒有明顯關(guān)系［13］。研究結(jié)果提示，神經(jīng)元受到創(chuàng)傷后，胞內(nèi)發(fā)生鈣超載的關(guān)鍵因素之一可能在于PMCA的異常。

5 GC介導(dǎo)PMCA調(diào)節(jié)TBI后胞內(nèi)鈣超載機(jī)制分析

通常認(rèn)為GC可以自由通過細(xì)胞膜，然后與胞質(zhì)內(nèi)受體及相關(guān)蛋白結(jié)合形成配體-受體復(fù)合體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA某些元件結(jié)合進(jìn)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程，一般認(rèn)為這個過程至少需要15 min。雖然近幾年研究發(fā)現(xiàn)，在某些細(xì)胞內(nèi)這兩個過程進(jìn)行是比較迅速的，但即便如此，基因組機(jī)制發(fā)生作用的時間也通常＞5 min;而GC所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化是極為迅速的，認(rèn)為這就是GC介導(dǎo)神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子調(diào)節(jié)的非基因組機(jī)制［15］。非基因組機(jī)制認(rèn)為，GC可以與膜相關(guān)受體結(jié)合，通過激活相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號通路迅速產(chǎn)生效應(yīng)［4］。非基因組過程具有一些不同于基因組機(jī)制的特點(diǎn)，如不能被轉(zhuǎn)錄和翻譯的抑制劑所阻滯，經(jīng)過修飾而不能穿透細(xì)胞的GC仍能夠引發(fā)相應(yīng)的效應(yīng)［16］。在尚未發(fā)現(xiàn)GC膜受體的情況下，這些特性也成為證明非基因組機(jī)制的常用方法。

GC介導(dǎo)的PMCA對神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)鈣瞬變的調(diào)控迅速，作用時間短于傳統(tǒng)的基因組機(jī)制，其作用機(jī)制可能在于非基因組調(diào)控機(jī)制。由GC介導(dǎo)的PMCA對神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)鈣瞬變的調(diào)控機(jī)制研究，其相關(guān)文獻(xiàn)報道較少，有待進(jìn)一步研究。

關(guān)于TBI的體外模型，近年來由于可變形培養(yǎng)皿的使用，取得了許多進(jìn)展。通過改變培養(yǎng)皿的底面積，模擬TBI狀態(tài)下神經(jīng)元的牽張損傷。并可通過計(jì)算機(jī)控制牽張的速度、幅度等參數(shù)，從而獲得更為穩(wěn)定的TBI體外模型。本研究的另一個關(guān)鍵是PMCA活性的測定。一般使用兩種方法:(1)一種是提取然后檢測 PMCA活性，這包括兩種措施:①一種是從細(xì)胞勻漿中提取膜結(jié)構(gòu)，聯(lián)合使用多種三磷酸腺苷酶(ATP酶)抑制劑，抑制除PMCA之外所有ATP酶的活性，就可以單獨(dú)測定PMCA分解底物的能力，從而鑒定其活性［17］;②另一種是從勻漿中通過親和色譜的方法提出泵蛋白，直接檢測其活性［18-19］;(2)另一種檢測PMCA活性的方法是通過觀察其清除胞質(zhì)內(nèi)鈣的能力，間接確定其活性。既往研究多是通過激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)鈣熒光變化，聯(lián)合膜片鉗控制細(xì)胞內(nèi)鈣升高的幅度，并抑制除PMCA之外所有的鈣清除分子，創(chuàng)造一個完全由PMCA介導(dǎo)的鈣清除過程，并以此為平臺，測定各種因素對于PMCA活性的影響。這種方法的缺點(diǎn)是可同時觀測的細(xì)胞只能為一個，樣本量受到限制;而且，所需設(shè)備昂貴，不易獲得。Chen等［13］曾將神經(jīng)元置于無鈣的緩沖液中一段時間，然后加入含鈣緩沖液，能夠迅速促使鈣離子內(nèi)流，從而使神經(jīng)元內(nèi)鈣離子升高，并以此作為平臺進(jìn)行研究。

6 結(jié)語

GC對TBI后神經(jīng)元具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制是多方面的，這不僅表現(xiàn)在GC具有強(qiáng)大的抗炎、抗氧化、穩(wěn)定細(xì)胞膜上，還可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元胞內(nèi)鈣代謝水平的變化，從而防止TBI后神經(jīng)元發(fā)生胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)而達(dá)到防止神經(jīng)元凋亡或壞死的作用。既往的研究主要集中于創(chuàng)傷后神經(jīng)元的鈣清除系統(tǒng)的異常，包括PMCA、NCX、SERCA和線粒體鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能異常;最近則發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激水平的GC不僅具有主動調(diào)節(jié)PMCA從而調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣代謝，同時還具有調(diào)節(jié)TBI后神經(jīng)元胞內(nèi)鈣超載的能力，這一系列的發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步闡明GC對TBI后神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制，也為 TBI后合理使用GC提供理論支持。

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