張玲萍，董文斌

（四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院新生兒科，四川 瀘州 646000）

·論著·

早產(chǎn)兒不同濃度氧暴露后外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)p47phox蛋白與活性氧產(chǎn)生的相關(guān)性研究*

張玲萍，董文斌

（四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院新生兒科，四川 瀘州 646000）

目的觀察早產(chǎn)兒不同濃度氧暴露后，外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）內(nèi)p47phox蛋白變化與活性氧（ROS）產(chǎn)生的相關(guān)性。方法32周以下早產(chǎn)兒不同濃度氧療48 h后，分離PBMCs，檢測(cè)PBMCs內(nèi)p47phox的定位情況、p47phox蛋白表達(dá)量及ROS的生成量。結(jié)果p47phox隨著吸氧濃度升高向細(xì)胞膜移位增加；p47phox的蛋白表達(dá)量及ROS生成量也隨著吸氧濃度的升高而增加。結(jié)論早產(chǎn)兒氧暴露后，p47phox可能通過更多的向胞膜移位，增加其表達(dá)量來引起ROS產(chǎn)生的增加。

早產(chǎn)兒；氧暴露；p47phox；活性氧

近年來，早產(chǎn)兒出生率顯著提高，早產(chǎn)兒因?yàn)榉伟l(fā)育不成熟需要不同方式的氧療支持。也正是因?yàn)檫@種通氣策略的改變，早產(chǎn)兒存活率也得到顯著的升高?？墒牵L(zhǎng)期高濃度供氧引起早產(chǎn)兒急、慢性肺損傷卻凸顯出來。有研究顯示，高氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）是其重要的發(fā)病機(jī)制[1-2]。機(jī)體產(chǎn)生活性氧有多種途徑，其中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是血管內(nèi)生成活性氧的主要酶體[3]，同時(shí)也在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這種表達(dá)有助于高氧誘導(dǎo)活性氧生成后，肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)和組織損傷[4]。NADPH氧化酶是由多亞基構(gòu)成的酶復(fù)合體，其中p47phox是NADPH氧化酶活性有關(guān)的重要調(diào)節(jié)因子。當(dāng)機(jī)體受到細(xì)胞因子、激素及炎癥等因素的刺激，p47phox會(huì)發(fā)生一系列變化，最終攜帶胞質(zhì)復(fù)合體定位在胞膜上，從而激活NADPH氧化酶，產(chǎn)生大量的活性氧[5-6]。本研究旨在觀察早產(chǎn)兒不同濃度氧暴露后，外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）內(nèi)p47phox蛋白定位及表達(dá)量的變化，與ROS的生成量的情況，來探討p47phox蛋白變化與活性氧產(chǎn)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），超凈工作臺(tái)（Thermo公司），倒置相差顯微鏡（Olympus公司），熒光顯微鏡（Olympus公司），激光共聚焦顯微鏡（Leica公司），全光譜分光光度儀（Eppendorf，德國(guó)），電泳儀（美國(guó)伯樂），GDS8000凝膠掃描系統(tǒng)（UVP，美國(guó)），超低溫冰箱（Thermo公司）等。

1.2 主要試劑

人淋巴細(xì)胞分離液（灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司），Mitosox Red（Invitrogen公司），DAPI（Sigma公司），抗熒光淬滅封片劑（碧云天公司），兔抗人p47phox抗體（Bioworld Technology），F(xiàn)ITC山羊抗兔IgG（中杉金橋公司），5XSDS上樣緩沖液（上海生工），蛋白裂解液（北京普利萊），10%分離膠（Amersham Pharmacia Biotech公司），4%濃縮膠（Amersham Pharmacia Biotech公司），X-光膠片（柯達(dá)公司），HRP二抗（GenScript公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶內(nèi)參一抗（GenScript公司）等。

1.3 研究對(duì)象及分組

以2013年收治于我科的32周以下早產(chǎn)兒為對(duì)象。將其中入院時(shí)診斷為新生兒呼吸窘迫綜合癥[7]且需要吸氧的患兒作為氧暴露組，根據(jù)吸氧濃度不同分為3組：FiO2<30%為低濃度吸氧組、FiO2在30%～40%為中濃度吸氧組、FiO2>40%為高濃度吸氧組。同期選擇10例32周以下無其他疾病且暫未吸氧的早產(chǎn)兒作為對(duì)照組。兩組患兒胎齡、出生體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。該實(shí)驗(yàn)通過四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患兒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前均征得家屬同意并簽署知情同意書。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)本采集氧暴露組早產(chǎn)兒吸氧48 h后，對(duì)照組患兒出生48 h后，均經(jīng)橈動(dòng)脈采血2 ml，置于肝素抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMCs。

1.4.2 熒光顯微鏡檢測(cè)PBMCs內(nèi)p47phox定位經(jīng)Ficoll密度梯度離心法分離得到PBMCs后，用少量RPIM 1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）重懸細(xì)胞，采用計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml；取100μl細(xì)胞懸液滴于防脫玻片上，觀察細(xì)胞貼附于玻片時(shí)，滴加少量4%多聚甲醛覆蓋住細(xì)胞層，固定20 min；洗滌細(xì)胞后，加入50μl封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育15min；洗滌細(xì)胞后，將磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）稀釋的p47phox抗體（1∶50）滴加于載玻片上，覆蓋住細(xì)胞層，4℃冰箱過夜；次日，將FITC標(biāo)記的山羊抗兔抗體稀釋后（1∶50）滴于載玻片上，37℃濕盒溫育1 h；洗滌細(xì)胞后，滴入30μl抗熒光淬滅劑封片并采用熒光顯微鏡采集圖像。Image Pro Plus軟件中的Line Profile（光譜廓線）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度分布[8]。

1.4.3 Western-blot檢測(cè)PBMCs內(nèi)p47phox蛋白表達(dá)量收集細(xì)胞，加入適量放射免疫沉淀分析裂解液。冰上操作后，高速離心，提取蛋白；紫外分光光度計(jì)，595 nm，1號(hào)管調(diào)零，制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程及R值，測(cè)量待測(cè)蛋白OD值，算出蛋白濃度；制備分離膠、蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉；取出聚偏二氟乙烯膜，緩沖液沖洗后，暗室內(nèi)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，膠片曝光顯影后收集結(jié)果。然后用UVP凝膠圖象處理系統(tǒng)Labworks 4.6軟件分析目的條帶的灰度值[9]。

1.4.4 熒光顯微鏡檢測(cè)PBMCs內(nèi)ROS水平首先將分離得到的PBMCs調(diào)整濃度為2×106個(gè)/ml。取100μl滴加于防脫玻片上，4%多聚甲醛固定20 min，洗滌細(xì)胞；按說明書配制Mito SOX探針，濃度為3.85μg/ml，滴加1 ml覆蓋住細(xì)胞層，37℃孵育30 min，洗滌細(xì)胞；每張玻片加入100μl DAPI藍(lán)色熒光染料染細(xì)胞核，3 min后，洗滌細(xì)胞；滴加30μl抗熒光淬滅劑于載玻片上進(jìn)行封片，激光共聚焦顯微鏡采集圖像；Image Pro Plus軟件測(cè)定圖像平均熒光強(qiáng)度，其熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，ROS表達(dá)越多[10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料采用率表示，χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較采用q檢驗(yàn)；兩變量間的關(guān)系采用直線相關(guān)進(jìn)行分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測(cè)PBMCs內(nèi)p47phox定位

采用Image Pro Plus軟件中的LineProfile測(cè)定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度分布（圖1）。對(duì)照組（見圖A）中，細(xì)胞1和2由1條直線穿過，對(duì)直線經(jīng)過區(qū)域的熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熒光強(qiáng)度曲線呈平臺(tái)狀均勻分布（A1、A2所示），說明p47phox主要均勻分布于胞質(zhì)中；低濃度吸氧組中，細(xì)胞熒光強(qiáng)度曲線也呈平臺(tái)狀，分布較均勻（B1、B2所示）；而中濃度吸氧組組中，部分細(xì)胞熒光強(qiáng)度曲線呈平臺(tái)狀（C1所示），p47phox在胞質(zhì)分布均勻，部分細(xì)胞熒光強(qiáng)度曲線呈兩側(cè)高中間低的雙峰狀（C2所示），說明p47phox在胞膜附近先升高，胞質(zhì)中降低，靠近胞膜處又升高，此時(shí)p47phox已主要聚集在胞膜附近，此為發(fā)生了p47phox移位的陽性細(xì)胞；而高濃度吸氧組中，細(xì)胞熒光強(qiáng)度分布呈明顯的雙峰狀，（D1、D2所示），p47phox向胞膜移位的陽性細(xì)胞更加明顯。

由于各組中p47phox移位的陽性細(xì)胞數(shù)不同，本實(shí)驗(yàn)前期結(jié)果已對(duì)其移位率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。對(duì)照組發(fā)生p47phox移位的細(xì)胞數(shù)僅為1.02%；低濃度吸氧組p47phox移位率為7.69%；中濃度吸氧組p47phox移位率為21.69%；而高濃度吸氧組中，p47phox移位率為53.07%，明顯高于其他3組（P<0.05）[11]。

2.2 Western-blot檢測(cè)PBMCs內(nèi)p47phox表達(dá)量

Western blot結(jié)果顯示，吸氧濃度的升高可誘導(dǎo)p47phox蛋白表達(dá)上調(diào)。對(duì)照組p47phox蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.26±0.024），低濃度吸氧組、中濃度吸氧組及高濃度吸氧組p47phox表達(dá)逐漸增加，分別為（0.70±0.028）、（0.81±0.013）及（0.84±0.023）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，各組間p47phox蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=144.49，P<0.01。與對(duì)照組相比，其余3組p47phox蛋白表達(dá)明顯增加，P<0.05。且高濃度吸氧組中p47phox蛋白表達(dá)明顯高于中濃度吸氧組和低濃度吸氧組，P<0.05。見圖2。

2.3 熒光顯微鏡檢測(cè)PBMCs內(nèi)ROS水平

對(duì)照組患兒PBMCs內(nèi)ROS平均熒光強(qiáng)度為（14.60±0.76）；低濃度吸氧組為（18.34±0.19）；中濃度吸氧組為（23.11±0.84）；高濃度吸氧組為(32.88± 1.32)（見圖3）。隨著吸氧濃度的升高，ROS的產(chǎn)生逐漸增加。與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且任何兩組間平均熒光強(qiáng)度均有差別（均P<0.05）。

2.4 p47phox蛋白表達(dá)與ROS產(chǎn)生的相關(guān)性分析

臨床中早產(chǎn)兒氧暴露48 h后，隨著吸氧濃度的升高，PBMCs內(nèi)ROS逐漸升高。同時(shí)氧濃度的升高還誘導(dǎo)p47phox蛋白表達(dá)上調(diào)，這與ROS升高的趨勢(shì)是一致的。經(jīng)直線相關(guān)進(jìn)行分析后，得到相關(guān)系數(shù)r=0.78，P<0.05，p47phox蛋白表達(dá)與ROS的產(chǎn)生呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。

圖1 免疫熒光檢測(cè)p47phox在PBMCs內(nèi)定位（×400）

圖2 外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)p47phox相對(duì)表達(dá)量

圖3 外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)活性氧水平（×200）

圖4 p47phox蛋白表達(dá)與ROS含量的散點(diǎn)圖

3 討論

氧療，是呼吸支持的重要方式。但長(zhǎng)期高濃度用氧引起的急、慢性肺損傷是造成早產(chǎn)兒尤其是極低出生體重兒死亡或致殘的重要原因。有研究顯示，在高氧環(huán)境機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量ROS是其發(fā)病的重要機(jī)制。NADPH氧化酶是一種過氧化物酶，廣泛存在于吞噬細(xì)胞及非吞噬細(xì)胞，其催化產(chǎn)物ROS就是參與氧化應(yīng)激損傷的重要因素。NADPH氧化酶主要由5個(gè)亞基組成，包括胞膜組分gp91phox、p22phox，胞質(zhì)組分p40phox，p47phox，p67phox和小分子的GTP結(jié)合蛋白R(shí)ac-1或Rac-2[12]。當(dāng)細(xì)胞受到相應(yīng)刺激后，胞漿亞基p47phox發(fā)生磷酸化，構(gòu)象發(fā)生改變與p67phox組裝并向胞膜轉(zhuǎn)位，與胞膜亞基p22phox結(jié)合，從而激活了NADPH氧化酶，將氧分子還原為單線態(tài)氧[13-14]，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激，造成組織細(xì)胞損傷。在此ROS的產(chǎn)生過程中，胞漿亞基p47phox起著樞紐性的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過早產(chǎn)兒氧暴露后，觀察PBMCs內(nèi)p47phox的變化與ROS的產(chǎn)生，來探討p47phox與ROS產(chǎn)生的關(guān)系。

前期研究發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)兒氧暴露后，隨著吸氧濃度的升高，p47phox向胞膜移位的細(xì)胞數(shù)增多。在機(jī)體受到刺激的情況下，p47phox向胞膜的移位率增加，這與國(guó)內(nèi)外眾多研究是相一致的。隨著研究不斷地深入，筆者進(jìn)一步在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著患兒用氧濃度升高，該組患兒PBMCs內(nèi)p47phox表達(dá)在逐漸增加。同時(shí)，ROS也在逐漸增多。這與p47phox的表達(dá)量是呈正相關(guān)的。這提示，用氧濃度的升高不僅可能增加p47phox向胞膜移位，還可能誘導(dǎo)p47phox蛋白表達(dá)上調(diào)。而p47phox可能通過增加向胞膜移位，上調(diào)其表達(dá)量，激活更多的NADPH氧化酶，產(chǎn)生更多的活性氧，加重早產(chǎn)兒機(jī)體組織的損傷。通過對(duì)這種機(jī)制的進(jìn)一步探索，有助于從源頭上控制過多活性氧的產(chǎn)生，以期為預(yù)防早產(chǎn)兒肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)或其他多種氧化應(yīng)激損傷性疾病提供新的治療靶點(diǎn)和臨床思路。

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Study on the relationship between p47phox and ros within pbmcs in premature infants after oxygen therapy*

Ling-ping ZHANG,Wen-bin DONG
(Department of Geriatrics,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou,Sichuan 646000,P.R.China)

【Objective】To observe the correlation of p7phox and ROS in PBMCs after different concentration oxygen exposure in preterm infants.【Methods】After oxygen therapy for 48 h in extremely premature infants.We isolated PBMCs from peripheral blood.Then detected the location and expression of p47phox and ROS within PBMCs.【Results】The higher oxygen concentrated,the more PBMCs have p47phox translocate to membrane,the expression of p7phox and ROS production raised as well.【Conclusion】After oxygen therapy,p47phox may increase the translocation,up-regulate expression to cause reactive oxygen species increasing.

premature infants;oxygen expose;p47phox;ROS

1005-8982（2015）34-0001-05

R72；R392

A

2015-05-25

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81571480）；中華兒科雜志第二屆雙鶴珂立蘇科研基金（No：cjp2011-009）；四川省衛(wèi)生廳科研基金（No：110340）

董文斌，E-mail：DongWenbin2000@163.com