徐賢寅，吳建強(qiáng)，於俊，柳楊

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院口腔科，江蘇 無錫 214023）

牙周炎患者齦溝液中高遷移率族蛋白B1與牙槽骨吸收程度的相關(guān)性研究*

徐賢寅，吳建強(qiáng)，於俊，柳楊

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院口腔科，江蘇 無錫 214023）

目的分析牙周炎患者齦溝液高遷移率族蛋白B1（HMGB1）水平與牙槽骨吸收程度的關(guān)系。方法選取58例牙周炎患者的58顆下頜單根牙為研究對(duì)象，收集每顆牙的齦溝液行ELISA法檢測HMGB1濃度，同時(shí)利用X線影像測量牙根長度和牙槽骨吸收高度，計(jì)算牙槽骨吸收比例。結(jié)果齦溝液HMGB1平均含量為（4.54±6.40）ng/mL，牙槽骨平均吸收比例為（0.19±0.13），兩者相關(guān)系數(shù)為0.81（P<0.01），呈正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論HMGB1參與了牙槽骨的吸收，在牙周炎的發(fā)展中可能起到重要作用。

高遷移率族蛋白B1；齦溝液；牙周炎

牙周炎是由病原體與宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一系列炎癥反應(yīng)，造成牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒脫落，進(jìn)而影響口頜系統(tǒng)的功能。針對(duì)炎性介質(zhì)與牙周炎關(guān)系的研究，已成牙周病研究的重點(diǎn)之一。有研究者通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)牙周炎患者齦溝液中高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）的含量明顯增高[1]。本研究擬通過對(duì)牙周炎患者齦溝液HMGB1的含量進(jìn)行檢測，并與患者牙槽骨吸收程度進(jìn)行比較，初步探討齦溝液HMGB1與牙周炎骨吸收的關(guān)系，籍此為HMGB1水平用于評(píng)估牙槽骨吸收情況提供檢測依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年10月-2015年3月在無錫市人民醫(yī)院口腔門診就診的成人牙周炎患者58例作為研究對(duì)象，參照《牙周病學(xué)》[2]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，男27例，女31例；平均41歲。5例健康單根牙作為對(duì)照。采用全景機(jī)拍攝根尖X線片（ORTHOPANTOMOGRAPH OP200 D芬蘭，球管電壓66 kV，電流6.2 mA，曝光時(shí)間14.1 s）。牙槽骨吸收比例=牙槽骨吸收高度/牙根長度。利用全景機(jī)自帶的測量工具測量釉牙骨質(zhì)界下1 mm至牙槽嵴頂?shù)拇怪本嚯x，即牙槽骨吸收高度[3]；測量釉牙骨質(zhì)界至根尖的垂直距離，即牙根長度。

1.2 齦溝液HMGB1采集與檢測

1.2.1 齦溝液HMGB1采集去除較大的菌斑，用無菌棉球擦干牙面，隔濕，輕吹牙齦，將15#紙捻輕輕插入檢測牙頰側(cè)近遠(yuǎn)中、舌（腭）側(cè)近遠(yuǎn)中齦溝中，遇輕微阻力時(shí)停止，在齦溝內(nèi)保留1 min后取出，若紙捻帶血?jiǎng)t舍去重新采集。采集完成后，測量浸潤部分的長度，剪去干燥部分，放入裝有PBS緩沖液的Ep管中，-70℃冷凍保存，用于后續(xù)檢測。

1.2.2 齦溝液HMGB1檢測齦溝液成分與健康人的血清相似，可根據(jù)健康人的血清體積與紙捻的浸潤長度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，來確定齦溝液的體積。取健康人的血清以0.1μl遞增，將0.1～2.0μl分為20組，用10μl微量加樣器取各組血清滴于相同的紙捻上，每組3條，游標(biāo)卡尺測量紙捻的浸潤長度。計(jì)算健康人的血清體積與紙捻長度的相關(guān)系數(shù)，并行直線相關(guān)t檢驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣本的紙捻浸濕長度計(jì)算GCF的體積[4]。

室溫下靜置，解凍標(biāo)本20 min，平衡至室溫，1 000 r/min，離心10 min，取上清液備用。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測，HMGB1試劑盒購自日本Shino-Test公司，按試劑盒使用說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行分析。采用Pearson相關(guān)分析對(duì)齦溝液HMGB1含量與牙槽骨吸收比例之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

5例健康單根牙齦溝液內(nèi)未檢測到HMGB1。58例患者臨床資料見附表，齦溝液HMGB1平均含量為（4.54±6.40）ng/ml，牙槽骨平均吸收比例為（0.19±0.13），兩者關(guān)系見附圖。

兩組數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 19.0軟件包，采用Pearson相關(guān)分析方法，在0.01水平（雙側(cè)）上顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)0.81。

附表 58例患者臨床資料

續(xù)附表

附圖 58例牙周炎患者齦溝液HMGB1含量和牙槽骨吸收比例關(guān)系圖

3 討論

牙周炎是一種破壞性疾病，其主要特征為牙周袋的形成及袋壁的炎癥，進(jìn)而引起牙槽骨吸收，最終牙齒逐漸松動(dòng)、脫落，它是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的主要原因。研究表明，多種炎癥介質(zhì)如白介素、腫瘤壞死因子等參與了牙周炎的進(jìn)展[5-8]。

高遷移率族蛋白是一類高度保守的非組蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移能力而得名。HMGB1是HMGB亞家族成員之一。由215個(gè)氨基酸組成，分子量約30 kDa，廣泛分布于各種組織細(xì)胞中，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)。研究顯示，HMGB1是一種DNA結(jié)合蛋白，在DNA結(jié)構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄、基因重組、DNA損傷修復(fù)以及細(xì)胞存活等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，通過與多種轉(zhuǎn)錄因子、復(fù)制蛋白、受體及重組酶等作用參與DNA重組、修復(fù)及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，細(xì)胞復(fù)制和分化成熟等多種生命活動(dòng)[9]。1999年，WANG等[10]發(fā)現(xiàn)HMGB1可以釋放到胞外并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，為一種重要的炎癥介質(zhì)，以后HMGB1作為炎癥介質(zhì)或促炎細(xì)胞因子逐漸引起廣泛重視，有研究表明HMGB1參與膿毒癥、肺炎、關(guān)節(jié)炎、急性胰腺炎、燙傷或腦梗死等諸多疾病的發(fā)病過程[11-12]。

最近幾年，HMGB1在牙周組織中的作用逐漸引起關(guān)注和重視。HMGB1作為一種重要的炎癥遞質(zhì)，在牙周炎患者的齦溝液中明顯增加，在健康者的齦溝液中則沒有變化[1]。EBE等[13]對(duì)牙周炎病變組織所進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色中：HMGB1主要分布于牙周袋上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，也分布于牙齦上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中；另一方面，大量存在于牙周袋中的致病菌代謝產(chǎn)物丁酸，通過誘發(fā)人牙齦上皮細(xì)胞的壞死而誘導(dǎo)HNGB1的被動(dòng)釋放。在牙周膜中，成纖維細(xì)胞是最主要的細(xì)胞，其受某些因素的刺激后能釋放HMGB1。孫欽峰等[14]通過觀察HMGB1對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子（RANKL）、骨保護(hù)因子（OPG）的影響，發(fā)現(xiàn)一定濃度的HMGB1可使牙周膜細(xì)胞中的RANKL/OPG比值增高，還會(huì)誘導(dǎo)炎癥因子IL-6 mRNA表達(dá)上調(diào)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在HMGB1的刺激下破骨作用有明顯提高，提示其加速了破骨的過程結(jié)果，據(jù)此推斷HMGB1在牙槽骨吸收破壞的過程中起著重要的作用[15]。本次研究發(fā)現(xiàn)，健康牙齒的齦溝液中未檢測到HMGB1；而牙周炎患者齦溝液中檢測到HMGB1存在，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1含量與牙槽骨吸收比例之間的存在正相關(guān)關(guān)系。結(jié)果證實(shí)HMGB1參與了牙槽骨的吸收，在牙周炎的發(fā)展中起到重要作用。

牙周炎是一個(gè)非常復(fù)雜的炎癥反應(yīng)過程，有多種炎癥因子參與其中，很難說某一炎癥因子在其中起了決定性的作用。本研究中，發(fā)現(xiàn)HMGB1與牙槽骨的吸收相關(guān)，在牙周炎的發(fā)展中可能起到重要作用，但是本研究中的樣本量尚小，今后仍需進(jìn)行較大樣本研究，同時(shí)進(jìn)行牙周基礎(chǔ)治療前后HMGB1水平的比較來作進(jìn)一步證實(shí)。

[1]MORIMOTO Y,KAWAHARA KI,TANCHAROEN S,et al.Tumor necrosis factor-α stimulates gingival epithelial cells to release high mobility-group box 1[J].J Periodont Res,2008,43(1): 76-83.

[2]孟煥新.牙周病學(xué)[M].第4版.人民衛(wèi)生出版社.2014:168-171.

[3]XU L,LOOS BG,CRAANDIJK J,et al.Teeth with periodontal bone loss,cigarette smoking and plasmaeotinine levels[J].J Int Acad Periodontol,2002,4(2):39-43.

[4]符蘇杰,王國平.種植體周圍齦溝液白介素-8水平的研究[J].口腔醫(yī)學(xué),2007,27(5):265-267.

[5]JURGINA SAKALAUSKIENE,DALIA GIEDRIMIENE,RICARDAS KUBILIUS,et al.Cytokine production by leukocytes in patients with periodontitis[J].Central European,2014,9(6):821.

[6]CHEN S,LIN G,YOU X,et al.Hyperlipidemia causes changes in inflammatory responses to periodontal pathogen challenge:implications in acute and chronic infections[J].Archives of Oral Biology,2014,59(10):1075.

[7]GARLET GP.Destructive and protective roles of cytokines in periodontitis:a re-appraisal from host defense and tissue destruction viewpoints[J].J Dent Res,2010,89(12):1349-1363.

[8]PADIAL-MOLINA M,VOLK SL,RODRIGUEZ JC,et al.Tumor necresis factor-α and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharides decrease periostin in human periodontal ligament fibroblasts [J].J Periodontal,2013,84(5):694-703.

[9]BUST IN M.Regulation of DNA dependent activities by the functional motifs of the high mobility group chromosomal proteins [J].Mol Cell Biol,1999,19(8):5237-5246.

[10]WANG H,BLOOM O,ZHANG M,et al.HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J].Science,1999,285 (5425):248-251.

[11]BIANCHI ME,MANF REDI AA.IMMU NOLOGY.Dangers in and out[J].Science,2009,323(5922):1683-1684.

[12]HUANG W,TANG Y,LI L.HMGB1,a potent proinflammat cytokine in sepsis[J].Cytokine,2010,51(2):119-126.

[13]EBE N,HARA-YOKOYAMA M,IWASAKI K,et al.Pocket epithelium in the pathological setting for HMGB1 release[J].J Dent Res,2011,90(2):235-240.

[14]孫欽峰,徐巖,宋暉,等.高遷移率族蛋白B1對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子影響的研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2010,29(4): 443-446.

[15]徐賢寅,殷之平,於俊,等.HMGB1對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的影響[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2013,29(9):541-543.

Correlation of HMGB1 in gingival crevicular fluid and degree of the alveolar bone resorption in periodontitis patients*

Xian-yin XU,Jian-qiang WU,Jun YU,Yang LIU
(Department of Stomatology,Wuxi People's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Wuxi,Jiangsu 214023,P.R.China)

【Objective】To analyze the relationship between HMGB1 in gingival crevicular fluid and the degree of the alveolar bone resorption in periodontitis patients.【Methods】58 single rooted teeth with periodontitis in the mandibular were selected.ELISA staining was used to determine the concentration of HMGB1 in the gingival crevicular fluid.The root length and height of alveolar bone resorption were measured in the X-ray film,and the resorption ratio of alveolar bone was calculated.【Results】The average content of HMGB1 in the gingival crevicular fluid was(4.54±6.40)ng/mL.The average content of resorption ratio of alveolar bone was(0.19±0.13).Pearson correlation was analyzed for HMGB1 and resorption ratio of alveolar bone.The correlation coefficients was 0.81(P< 0.01),positived correlation.【Conclusion】HMGB1 is involved in the resorption of alveolar bone,and plays an important role in the development of periodontitis.

high mobility group box 1(HMGB1);gingival crevicular fluid;periodontitis

1005-8982（2015）34-0097-04

R781.42

B

2015-06-21

2012年無錫市科技發(fā)展指導(dǎo)性計(jì)劃（No：CSZ00N1201）

徐賢寅，E-mail：imaginal_line@sian.com，Tel：0510-82700778