翟　競，　姜　紅，　夏建國，　丁永斌，　魏　尉

抑癌基因TSPYL5在胃癌中的表達(dá)及與遠(yuǎn)期生存的關(guān)系

翟競，姜紅，夏建國，丁永斌，魏尉

作者單位： 210029江蘇南京，江蘇省中醫(yī)院消化腫瘤外科(翟競)；210029江蘇南京，江蘇省人民醫(yī)院

普外科(姜紅，夏建國，丁永斌)；210009江蘇南京，江蘇省腫瘤醫(yī)院普外科(魏尉)

第一作者： 翟競，女，碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向：消化系腫瘤的研究，E-mail:birthday0429@163.com

【摘要】目的研究胃癌組織及其鄰近胃組織中睪丸特異性Y樣蛋白5(testis-specific Y-like protein 5，TSPYL5)的表達(dá)與預(yù)后及多個(gè)臨床病理變量之間的關(guān)系，同時(shí)分析其是否在胃癌遠(yuǎn)期生存的危險(xiǎn)因素中具有意義。方法采用RT-PCR方法檢測44例胃癌組織、癌旁胃正常黏膜組織中TSPYL5 mRNA 的表達(dá)，分析其表達(dá)與胃癌相關(guān)臨床病理變量的關(guān)系。結(jié)果與癌旁組織相比，胃癌組織中TSPYL5表達(dá)明顯下調(diào)的有24例，占總數(shù)的54.5%。TSPYL5的表達(dá)與TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移及是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與腫瘤的浸潤深度、大小及患者性別、年齡等無關(guān)(P<0.05)。腫瘤組織與癌旁組織的TSPYL5表達(dá)量相比，其表達(dá)下調(diào)者的DFS遠(yuǎn)低于無明顯變化及上調(diào)者(P=0.01)。經(jīng)單因素和多因素COX分析表明，TSPYL5可作為胃癌的獨(dú)立預(yù)測因素(P<0.001)。結(jié)論TSPYL5作為抑癌基因，其表達(dá)缺失參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)TSPYL5可作為判斷胃癌預(yù)后的重要分子標(biāo)志。

【關(guān)鍵詞】TSPYL5；抑癌基因；甲基化；胃癌；預(yù)后

The relationship between expression and long term survival of tumor suppressor gene TSPYL5 in gastric cancerZHAIJing1，JIANGHong2，XIAJianguo2，DINGYongbin2，WEIWei3(1.DepartmentofDigestiveTumorsSurgery，JiangsuProvinveHospitalofTCM,Nanjing210029，China；2.DepartmentofGeneralSurgery，JiangsuProvinceHospital，Nanjing210029，China；3.DepartmentofGeneralSurgery，JiangsuCancerHospital，Nanjing210009，China)

Correspondingauthor：WEIWei，E-mail:weiwei_DR@126.com

Abstract：ObjectiveTo study the relationship between the expression of TSPYL5(testis-specific Y-like protein 5，TSPYL5)in gastric carcinoma and adjacent gastric tissues and the long term survival. Our study is to investigate the clinical significances of expression of TSPYL5 in gastric cancer.MethodsThe mRNA level of TSPYL5 in 44 matched samples comprising primary gastric carcinoma and paired non-cancerous mucosa were detected and compared by quantitative RT-PCR. Then the correlations of mRNA level of TSPYL5 with the clinicopathological characteristics and prognosis of patients with gastric cancer were analyzed.ResultsThe rate of TSPYL5 mRNA in the primary gastric cancer tissues was significantly higher than that in the adjacent non-cancerous tissues(54.5%)．mRNA expression of TSPYL5 was associated with certain clinical-pathologic variables such as advancing TNM stage， lymphatic metastasis， distant metastasis. We obtained the expression levels ratio of cancer tissue and adjacent non-cancerous tissues and found the lower ratio with a lower Disease-Free Survival(DFS)(P<0.001).TSPYL5，as a tumor suppressor gene， remained a statistically-significant prognostic marker in the COX regression analysis.ConclusionDown-expression of TSPYL5 had a significant effect on development and progress in gastric cancer，which can be used to prognose gastric carcinoma.

Keywords：TSPYL5; tumor suppressor gene; methylation; gastric cancer; prognostic

中國是胃癌高發(fā)的地域之一，每年新發(fā)病例約占全球總數(shù)的一半，死亡率更是高居前列。目前胃癌的發(fā)生發(fā)展與眾多因素有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)通過檢測人胃癌組織和正常組織TSPYL5的mRNA表達(dá)，以及經(jīng)行5年生存率的遠(yuǎn)期隨訪來研究TSPYL5的表達(dá)和胃癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，為今后研究胃癌的發(fā)病機(jī)制、檢測監(jiān)測以及治療等方面提供新的研究方向。

1材料與方法

1.1病例選擇入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)選用江蘇省人民醫(yī)院2008年4月至2008年12月胃腸外科行胃癌根治術(shù)切除的胃癌患者46例，其中男28例，女18例，年齡39～78(平均59.13)歲。(2)入組者均通過手術(shù)治療，采用標(biāo)準(zhǔn)的D2根治術(shù)，全部隨訪患者未出現(xiàn)并發(fā)癥，無圍手術(shù)期死亡。(3)均未進(jìn)行術(shù)前新輔助化療。入選患者中1例在術(shù)后18個(gè)月死于腦血管意外，1例在術(shù)后3個(gè)月死于大面積心肌梗死。失訪和非本病死亡病例不納入統(tǒng)計(jì)，實(shí)際統(tǒng)計(jì)患者44例。

1.2實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR按Invitrogen公司TRIzol試劑盒說明方法提取組織總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。合成TSPYL5引物：上游引物為5′-TGGGAACAGCGGGAACCGT-3′，下游引物為5′-CTGCATCCCTCTCTTCCTTC-3′；內(nèi)參照β-actin的上游引物為5′-CTCACGAAACTGGAATAAGC-3′下游引物為5′-AAGCCACACGTACTAAAGGT-3′。PCR 反應(yīng)體系：ddH2O 15.4μl，buffer 2μl，dNTP 0.4μl，cDNA 1μl，上/下游引物(10pmol/L)各0.5μl，Taq plus 0.2μl，反應(yīng)總體積為20μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72℃7min。β-actin的PCR反應(yīng)時(shí)退火溫度為56℃，其余同前。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳20min后，于凝膠成像及分析儀上進(jìn)行成像分析，于218bp處出現(xiàn)目的條帶判為TSPYL5 mRNA陽性表達(dá)。我們得到樣品中TSPYL5基因及β-actin基因的Ct值，并通過β-actin的Ct值對(duì)TSPYL5基因進(jìn)行差值校正，最終得到相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)來分析mRNA表達(dá)差異。無病生存率(DFS)應(yīng)用生存曲線以圖表的形式展現(xiàn)，并且應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)檢測組間生存差異?；颊呒跋嚓P(guān)的臨床變量與其無病生存期之間的關(guān)系應(yīng)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型來評(píng)估。所有的分類數(shù)據(jù)均應(yīng)用χ2或Fisher精確概率檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算，數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS22.0軟件，雙側(cè)檢驗(yàn)P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1癌組織及癌旁組織TSPYL5表達(dá)情況根據(jù)癌組織及癌旁組織之間TSPYL5表達(dá)量的比較，得出其表達(dá)下調(diào)者24例，表達(dá)上調(diào)者8例，無差異者12例，大多數(shù)的腫瘤組織中其表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)的癌旁組織(P<0.05)。

2.2TSPYL5的表達(dá)與臨床病理各變量之間的關(guān)系根據(jù)我們的統(tǒng)計(jì)分析，TSPYL5的表達(dá)和TNM分期以及是否出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與腫瘤本身浸潤的深度無關(guān)。在TNM分期中，越是早期的患者TSPYL5的表達(dá)缺失就越明顯，而到了晚期反而出現(xiàn)了TSPYL5的再表達(dá)，特別是有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，TSPYL5均出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào)(表1)。由此提示，TSPYL5的表達(dá)缺失在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期起關(guān)鍵的作用，而在腫瘤的晚期由于其出現(xiàn)了再表達(dá)，我們推測其抑癌作用不明顯甚至出現(xiàn)缺失。

2.3TSPYL5的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系為了便于TSPYL5表達(dá)程度變化的統(tǒng)計(jì)，我們將癌組織中TSPYL5的表達(dá)量與癌旁組織中TSPYL5的表達(dá)量相比，得到的比值定義為T，繼而我們根據(jù)T值的大小，將所有44例數(shù)據(jù)分成3組進(jìn)行預(yù)后的分析，其中1組為T≤0.5(即下調(diào))；2組為0.5

2.4單變量及多變量分析單因素COX模型分析顯示DFS與腫瘤TNM分期(P=0.001)，是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.005)，以及TSPYL5的表達(dá)(P=0.019)有關(guān);應(yīng)用COX回歸模型對(duì)有意義的預(yù)后相關(guān)因素進(jìn)行多因素生存分析后顯示，TSPYL5的表達(dá)可作為大腸癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素(P<0.001)(表2)。

表1　TSPYL5 mRNA表達(dá)量與臨床病理特點(diǎn)之間的聯(lián)系

圖1　生存曲線

3討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展與眾多因素有關(guān)，抑癌基因的甲基化作為表觀遺傳學(xué)最重要的修飾方式之一，最近成為研究的新熱點(diǎn)[1-2]。TSPYL5基因?qū)儆赥SPYL家族中的一員,根據(jù)現(xiàn)有的研究顯示，TSPYL5在許多腫瘤中都出現(xiàn)表達(dá)的缺失或者下調(diào)[3]，因此TSPYL5被認(rèn)為是一種新的抑癌基因[4]。作為新的抑癌基因，我們對(duì)其作用機(jī)制尚不十分了解，有觀點(diǎn)認(rèn)為TSPYL5存在啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)的表達(dá)沉默，正是這種表達(dá)沉默導(dǎo)致腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展。在針對(duì)乳腺癌患者的研究表明，TSPYL5存在表達(dá)下調(diào)[5]，他是通過作用于泛素特異性蛋白酶7 ubiquitin-specific protease 7(USP7；also known as herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease；HAUSP)來降低P53蛋白的水平，從而抑制P53靶基因的活性[6]。Kim等[7]研究發(fā)現(xiàn)TSPYL5在原發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中存在啟動(dòng)子的高甲基化(接近100%)，同時(shí)其表達(dá)下調(diào)，但在正常的腦組織中幾乎沒有甲基化。Vachani等[8]在頭頸肺部鱗狀細(xì)胞癌的研究中也發(fā)現(xiàn)TSPYL5存在明顯的表達(dá)下調(diào)。作為一個(gè)新興的抑癌基因TSPYL5已經(jīng)越來越受到人們的重視，關(guān)于TSPYL5的研究也越來越多，但很少有關(guān)于TSPYL5表達(dá)量與胃癌預(yù)后的相關(guān)分析的報(bào)道。本研究收集了江蘇省人民醫(yī)院2008年資料完整的44例病例作為研究對(duì)象，從每個(gè)研究對(duì)象的成對(duì)標(biāo)本中(癌組織與癌旁組織)提取mRNA，并通過RT-PCR的方法獲得每個(gè)組織中TSPYL5的mRNA表達(dá)量，從而對(duì)TSPYL5的表達(dá)量與生存期之間的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。

表2　胃癌預(yù)后單變量及多變量的分析

Jung等[9]對(duì)9種胃癌細(xì)胞株及胃癌組織中TSPYL5的研究認(rèn)為，其表達(dá)沉默以及其啟動(dòng)子高甲基化與胃癌密切相關(guān)。我們的研究也顯示，大多數(shù)的胃癌腫瘤組織中TSPYL5的表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)的癌旁組織，這表明TSPYL5基因低表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，從而也進(jìn)一步突出了TSPYL5作為抑癌基因需要深入研究的重要性。本研究表明，TSPYL5的表達(dá)量與腫瘤的浸潤深度及T分期無明顯相關(guān)性，但是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者TSPYL5的表達(dá)明顯低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者TSPYL5表達(dá)高于無轉(zhuǎn)移患者。這些均提示TSPYL5參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。在生存預(yù)后方面，我們可以看出，生存曲線中前12個(gè)月的DFS幾乎相同，之后3條曲線逐漸分開，隨后R值越高的組，其DFS也越高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步的研究顯示，作為單變量包括TSPYL5在內(nèi)的3個(gè)臨床變量與預(yù)后相關(guān)(腫瘤的臨床TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及TSPYL5的表達(dá)量)，而其中只有TSPYL5的表達(dá)量可作為胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.001)。值得注意的是，TSPYL5的表達(dá)在Ⅰ、Ⅱ期的患者中要低于Ⅲ、Ⅳ期，這與一般抑癌基因不同，同時(shí)COX模型分析中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移這一在TSPYL5表達(dá)量中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臨床變量對(duì)胃癌患者的遠(yuǎn)期預(yù)后卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)影響。結(jié)合TSPYL5存在啟動(dòng)子甲基化所致的基因失活理論，我們推測TSPYL5在腫瘤早期發(fā)展中作用較明顯，在腫瘤發(fā)展的中晚期可能出現(xiàn)部分TSPYL5無意義的再表達(dá)。TSPYL5即使出現(xiàn)表達(dá)量的上升但對(duì)遠(yuǎn)期預(yù)后沒有影響，相對(duì)于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移出現(xiàn)較早，因此淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移是一個(gè)判斷TSPYL5表達(dá)量與預(yù)后相關(guān)的臨床變量。本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要意義在于闡明了TSPYL5的表達(dá)量對(duì)胃癌預(yù)后判斷的重要作用，同時(shí)也證明了TSPYL5的表達(dá)量在腫瘤的早期存在表達(dá)缺失，到了腫瘤晚期有部分重新表達(dá)的可能，這使得TSPYL5不僅僅可作為一個(gè)判斷預(yù)后指導(dǎo)治療的新的基因靶點(diǎn)，也是一個(gè)早期篩查的更為特異性的指標(biāo)。

TSPYL5作為新一代抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有大量的研究表明啟動(dòng)子甲基化是其表達(dá)缺失的重要原因。目前，TSPYL5表達(dá)下調(diào)與癌癥發(fā)生之間的深層次的機(jī)制還不清楚，但作為TSPYL家族中的成員，其共有的NAP區(qū)域在組蛋白和DNA組裝成核小體的過程中起重要作用[10]。并且有研究表明，TSPYL家族中的另一重要的抑癌基因TSPYL2可能通過激活p53和MEK/ERK1/2 MAPK通路來上調(diào)p21蛋白發(fā)揮抑制作用[11-12]。本文推測TAPYL5可能通過一些保守的通路比如p16[13-14]NF-ΚB[15-16]、WNT[17-18]等來發(fā)揮抑制作用。同時(shí)其為何會(huì)出現(xiàn)晚期的再表達(dá)的原因也尚未見報(bào)道，在今后的研究中我們將深入討論其作用機(jī)制及特點(diǎn)，為尋找新一代腫瘤篩查指標(biāo)提供分子生物學(xué)依據(jù)。

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[收稿日期：2015-04-10][本文編輯：戴雅玥]臨床與基礎(chǔ)研究

文章編號(hào)：1674-4136(2015)05-0278-05

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2015.05.002

通訊作者：魏尉，男，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：胃腫瘤的研究，E-mail:weiweiDR@126.com

基金項(xiàng)目：六大人才高峰(2013-WSW-028)