孟麗娟，　王　峻，　樊衛(wèi)飛，　蒲驍麟，　許菊青，　王　琳，　楊　民，　劉福銀

miR-17-5P對肺癌細胞株A549、SPCA-1和GLC-82的增殖及侵襲能力的影響

孟麗娟，王峻，樊衛(wèi)飛，蒲驍麟，許菊青，王琳，楊民，劉福銀

【摘要】目的探討miR-17-5P對肺癌細胞株A549、SPCA-1及GLC-82增殖及侵襲能力的影響及其分子機制。方法利用化學合成的miR-17-5P mimics及miR-17-5P inhibitor轉染A549、SPCA-1及GLC-82肺癌細胞株，通過MTT、Transwell小室遷移實驗、Boyden小室侵襲實驗觀察過表達及抑制表達miR-17-5P后細胞遷移、侵襲能力及生長的變化；Western blot檢測細胞周期、上皮間葉轉變(EMT)標志物相關蛋白。結果MTT法顯示，與對照組比較，過表達miR-17-5P組細胞生長速度增加(P<0.001)；miR-17-5P表達抑制后，細胞生長速度降低(P<0.001)。Transwell及Boyden實驗顯示過表達組細胞穿過聚碳酸酯膜的數量多于對照組(P<0.001)，抑制表達后細胞穿膜數減少，并少于對照組(P<0.001)。Western blot示，與對照組比較，過表達miR-17-5P的A549、SPCA-1及GLC-82細胞中，CCND1、N-CA、Vimentin表達上調，抑制miR-17-5P的A549、SPCA-1及GLC-82細胞中，CCND1、N-CA、Vimentin表達下調。結論miR-17-5P可能通過上調CCND1、Vimentin、N-CA促進肺癌細胞株A549、SPCA-1及GLC-82的增殖、遷移及侵襲。

【關鍵詞】miR-17-5P；肺癌；增殖；侵襲

The impose of miR-17-5P over cell proliferation and invasion in lung cancer cells A549, SPCA-1 and GLC-82MENGLijuan,WANGJun,FANWeifei,PUXiaolin,XUJuqing,WANGLin,YANGMin,LIUFuyin.(DepartmentofHematologyandOncology,JiangsuProvinceGeriatricHospital,Nanjing210024,China)

Correspondingauthor:WANGJun,E-mail:madam_wangjun@163.com

Abstract：ObjectiveThe aim of this study was to investigate the effect and molecular mechanism of miR-17-5P over cell proliferation and invasion in lung cancer cells A549 , SPCA-1 and GLC-82.MethodsmiR-17-5P mimics and inhibitor were synthesized and transfected into lung cancer cells A549, SPCA-1 and GLC-82. The abilities of cell growth，migration and invasion were examined by MTT，Transwell， and Boyden chamber. Westen blot was used to test the expression of cell cycle and EMT-associated proteins.ResultsCompared with the control group，over expression of miR-17-5P improved A549, SPCA-1 and GLC-82 cells growth and number across polycarbonate membrane(P<0.001). While miR-17-5P expression was inhibited, cells growth and number across polycarbonate membrane were improved(P<0.001). Over expression of miR-17-5P upregulate the expression of CCND1，Vimentin and N-CA in A549, SPCA-1 and GLC-82. Meantime, expression of CCND1，Vimentin and N-CA was downgraded when expression of miR-17-5P was inhibited. ConclusionmiR-17-5P may facilitate cell proliferation, migration and invasion in A549 , SPCA-1 and GLC-82, by which mechanism is related to the improvement of expression of CCNDl，Vimentin and N-CA．

Keywords：miR-17-5P；lung cancer；proliferation；invasion

抽樣調查顯示，1988年至2005年間，我國肺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，年平均增長1.63%，其中男性為1.30%，女性為2.34%[1]。microRNAs(miRNAs)是一類進化上保守的內生的長度為20～24個核苷酸的非編碼小分子RNA，具有在翻譯水平調控基因表達的功能。據推測，miRNA調節(jié)著人類三分之一的基因。miR-17-5p與多種腫瘤發(fā)病相關，在肺癌中亦過表達。本文通過MTT、Transwell小室遷移實驗、Boyden小室侵襲實驗觀察miR-17-5p在肺癌細胞株中增殖及侵襲能力，利用Westen blot檢測細胞周期、上皮間葉轉變(EMT)標志物相關蛋白來探討其在肺癌發(fā)病中的分子機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1肺癌細胞株肺癌細胞株A549、SPCA-1及GLC-82均由南京醫(yī)科大學腫瘤研究所饋贈。肺癌細胞株SPCA-1和GLC-82采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，A549細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。分別在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)，細胞生長狀態(tài)良好時用于后續(xù)實驗。文中過表達miR-17-5P的細胞株分別表示為miR-17-5P mimics A549、miR-17-5P mimics SPCA-1及miR-17-5P mimics GLC-82，miR-17-5P表達抑制的細胞株分別表示為miR-17-5P inhibitor A549、miR-17-5P inhibitor SPCA-1及miR-17-5P inhibitor GLC-82，對照組細胞株分別以NC-A549、NC-SPCA-1及NC-GLC-82表示。

1.1.2主要試劑Opti-MEM、RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國HyClone公司)； TurboFect siRNA Transfection Reagent( Fermentas公司)；Transwell小室(孔徑8μm，Corning公司)；瑞氏-吉姆薩染色試劑盒(廣州儷科貿易有限公司)；二甲基四氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)( Amersco公司)：RIPA、PMSF蛋白裂解液(上海閃晶分子生物科技公司)；細胞周期相關抗體(Santacmz公司)；EMT相關標志物抗體(美國cell Signaling Technology 公司)；增強型化學發(fā)光檢測試劑盒(Millipore公司)。β-actin(鼠抗)、HRP標記的抗鼠二抗、抗兔二抗(南京生興生物)。

1.1.3主要儀器和設備CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；垂直凝膠電泳系統(tǒng)及蛋白質轉膜、高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1miRNA mimics和inhibitormiR-17-5P mimics和inhibitor由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。miR-17-5P mimics序列為：CAA AGU GCU UAC AGU GCA GGU AG；miR-17-5P inhibitor序列為：CUA CCU GCA CUG UAA GCA CUU UG。

1.2.2瞬時轉染按照廣州銳博生物技術公司mimicsRNA的操作說明進行。轉染前1 d，分別接種約2×105A549、SPCA-1及GLC-82細胞于6孔板中，在細胞密度達到30%～50%匯合度時進行轉染。吸去舊培養(yǎng)基，每孔加入1 500μl完全培養(yǎng)基。將5μl 20μmol/L has-miR-17-5P mimics加入到250μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻；另用250μl Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋1μl TurboFect siRNA Transfection Reagent，輕柔混勻，室溫孵育5 min；混合Opti-MEM-脂質體與Opti-MEM-mimics，室溫孵育20 min，形成轉染復合物；然后將上述混合物加到細胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻。在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。最終mimics終濃度為50 nmol/L，每孔總液體量為2 ml。48 h收集細胞行Transwell小室遷移和Borden小室侵襲實驗，72 h提蛋白。

miR-17-5P inhibitor轉染時20 μmol/L has-miR-17-5P inhibitor用量為10 μl，最終inhibitor終濃度為100 nmol/L，每孔總液體量為2 ml，余步驟同mimicsRNA轉染。

1.2.3噻唑藍(MTT)比色法檢測過表達及抑制表達miR-17-5P對肺癌細胞增殖的影響以每孔3.5×103個細胞接種于96孔板中，每孔體積200 μl，每組5個復孔，同時設空白對照(僅加培養(yǎng)基)，分別連續(xù)培養(yǎng)3 d。每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄掉孔內培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μl，室溫孵育10 min，微振蕩器振蕩10 min。使結晶物充分溶解，以空白對照孔調零，用酶標儀測定490 nm波長處細胞吸光度值(A值)，以相應的A比值表示細胞生長能力。各組取5個孔平均值，重復3次，繪制生長曲線。

1.2.4Transwell小室遷移實驗實驗前將小室取出，加入300 μl無血清培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中孵育1～2 h，使聚碳酸酯膜親水。將生長狀態(tài)良好的培養(yǎng)細胞用胰酶消化后制成單細胞懸液，用無血清培養(yǎng)基洗滌2次后計數。調整細胞濃度為1×106/ml。加100 μl細胞懸液于內室，然后加500 μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基于下室，37℃培養(yǎng)12 h。取出小室，用棉簽輕輕擦掉未穿過膜的細胞，甲醇固定15 min，棄甲醇后空氣干燥，用Giemsa染液染色5 min。用蒸餾水輕輕地沖洗數次，空氣中風干。用刀片小心切下聚碳酸酯膜，置于載玻片上。中性樹膠封片。顯微鏡下隨機選取5個高倍視野計數穿過膜的細胞數，重復3次。

1.2.5Boyden小室侵襲實驗每個小室matrigel基質膠1.62 μl/孔，無血清培基43.37 μl/孔，37℃培養(yǎng)箱中放置4 h，備用。其余步驟同Transwell小室遷移實驗。

1.2.6Westen blot檢測細胞周期、EMT標志物相關蛋白的變化配制10%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠，取30 μg蛋白質，與4×SDS上樣緩沖液按體積比3∶1混合，金屬浴10 min，冰上放置2 min，加樣、電泳，濃縮膠80 V電泳30 min，分離膠100 V電泳90 min。采用濕轉法轉膜，350 mA，90～120 min。轉膜成功后進行免疫雜交。先從轉印夾層中取出PVDF膜，放入裝有封閉液(含5%BSA的TBST)的平皿中浸泡，室溫孵育1 h。用封閉液稀釋一抗，再加目的基因單克隆抗體(用封閉液1∶1 000稀釋)和β-actin鼠抗人單克隆抗體(用封閉液1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h后4℃孵育過夜。次日取出膜，用TBST洗膜3次，每次5 min。分別加入HRP標記的抗兔、抗鼠二抗(體積比1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。化學發(fā)光檢測，膜稍滴干后置于暗盒內，加入化學發(fā)光試劑孵育。迅速曝光，曝光時間為10 s～1 min。高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)掃描記錄。

1.3統(tǒng)計學分析

2結果

2.1miR-17-5P mimics及inhibitor轉染成功后miR-17-5P表達情況

與對照組相比，A549、SPCA-1及GLC-82細胞株轉染miR-17-5P mimics后細胞株中miR-17-5P表達均顯著升高；轉染miR-17-5P inhibitor后miR-17-5P表達均顯著受抑(P<0.001)(圖1)。

**：與對照組相比，P<0.001。

與未轉染miR-17-5P mimics的對照細胞相比,過表達miR-17-5P的A549、SPCA-1及GLC-82細胞體外增殖能力增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；轉染miR-17-5P inhibitor后，細胞體外增殖能力減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖2)。

**：與對照組相比，P<0.001。

2.2Trallswell小室檢測miR-17-5P對肺癌細胞轉移能力的影響

與對照組相比，過表達miR-17-5P的細胞體外遷移能力增強，miR-17-5P表達抑制后細胞遷移能力減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖3。

**：與對照組相比，P<0.001。

與對照組相比，過表達miR-17-5P的細胞體外侵襲能力增強，miR-17-5P表達抑制后細胞遷移能力減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖4。

**：與對照組相比，P<0.001。

以βactin為內參，結果顯示：與對照細胞相比，過表達miR-17-5P的A549、SPCA-1及GLC-82細胞中，CCND 1、N-CA、Vimentin表達均上調，P21、P15則無明顯變化。抑制miR-17-5P表達的A549、SPCA-1及GLC-82細胞中，CCND 1、N-CA、Vimentin表達均下調，P21、P15則無明顯變化。見圖5。

**：與對照組相比，P<0.001。

圖5Westen blot檢測過表達及抑制表達miR-17-5P后，A549、SPCA-1及

GLC-82細胞中CCND 1、P21、P15、N-CA、Vimentin蛋白的表達情況

3討論

肺癌是當今世界最常見的惡性腫瘤之一，每年大約130萬患者死于肺癌，位于癌癥病死的首位。研究顯示肺癌5年存活率僅17.1%[2]。近年來，miRNA作為轉錄后調控網絡中的重要調控因子，其重要性和普遍性逐漸被人們認識，越來越受到關注。microRNAs (miRNAs)是一類最新發(fā)現的非編碼小分子RNA，可調控大量編碼蛋白基因的表達，他主要通過與靶標基因3’UTR的完全或不完全配對，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，參與調控細胞凋亡、增殖及分化等生命活動。miRNAs可通過調控其靶標基因參與的信號通路，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，發(fā)揮著類似于癌基因或抑癌基因的功能。miRNAs失調在腫瘤中起重要作用[3-4]。

miR-17-5p屬于 miR-17-92簇。miR-17-92簇定位于人類染色體13q31-q32上，位于一個具有開放讀碼框的基因C13 or f25內，編碼7個miRNAs：miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1。miR-17-92簇受原癌基因Myc調控，具有癌基因和抑癌基因的雙重功能。文獻表明miR-17-92主要通過抑制促凋亡因子Bim、細胞周期相關基因CDKN1/P21、腫瘤抑制基因PTEN以及TGFβ信號通路等靶基因發(fā)揮作用，但在不同類型的腫瘤中所起作用的關鍵靶基因不一致。雖然上述報道證實miR-17-92簇具有原癌基因的功能，但在16.5%卵巢癌、21.9%乳腺癌和20%黑色素瘤中發(fā)現了因13q31.3位點雜合型缺失(loss-of- heterozygosity，LOH)而引起miR-17-92簇缺失。過表達miR-17的乳腺癌細胞株細胞增殖受抑制，且miR-17/20可抑制乳腺癌細胞浸潤和轉移。由此反映了miR-17-92簇功能的復雜性和多面性，提示其在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同的功能。有研究顯示，在細胞龐大的調控網絡中，miR-17-5p是調節(jié)細胞周期G1/S轉化的關鍵因子[5]。

miR-17-5p在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌及胃癌等多種腫瘤中異常表達[6-11]。Ebi等[6]發(fā)現在小細胞肺癌中miR-17-5p和miR-20a過表達。在肺鱗癌組織中miR-17-92表達明顯高于正常肺組織[7]。Matsubara等[12]發(fā)現在miR-17-92簇高表達的細胞肺癌株中，應用miR-17-5p和miR-20a抑制劑可以誘導細胞凋亡，但miR-17-92簇中其他成員miR-18a和miR-19a抑制劑卻沒有同樣的效應。Chen等[13]應用了RT-qPCR檢測了20例肺癌患者癌組織和鄰近區(qū)域正常組織中的miRNA-17-5p表達水平，221例肺癌患者血清和54名健康者血清miRNA-17-5p表達水平。結果顯示肺癌組織中miR-17-5p表達升高，并且，與健康者相比，患者血清miR-17-5p表達水平亦顯著升高；生存分析顯示，血清miR-17-5p表達越高，生存時間越短。血清miR-17-5p表達水平可能是潛在的肺癌預后標志。本研究通過轉染miR-17-5p mimics促進miR-17-5p表達，發(fā)現肺癌細胞株A549、SPCA-1及GLC-82體外增殖能力明顯增強，同時，轉染miR-17-5p inhibitor抑制miR-17-5p表達后，細胞株的體外增殖能力顯著下降，組間差異有顯著性。隨后的Trallswell小室實驗及Boyden小室實驗檢測細胞的轉移及侵襲能力，均發(fā)現轉染了miR-17-5p mimics后，細胞株的轉移及侵襲能力得到提升，轉染miR-17-5p inhibitor后，轉移及侵襲能力顯著下降。進一步研究發(fā)現，細胞株在轉染了miR-17-5p mimic后，細胞周期蛋白CCND1及EMT相關標志物N-CA、Vimentin表達上調；而轉染miR-17-5p inhibitor可以下調該組蛋白表達。本研究結果表明miR-17-5p可以促進肺癌細胞株A549、SPCA-1及GLC-82體外增殖能力和轉移侵襲能力，同時，miR-17-5p與CCND 1、N-CA、Vimentin的表達相關。

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[收稿日期：2015-06-03][本文編輯：李筱蕾]論著

文章編號：1674-4136(2015)05-0282-05

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2015.05.003

通訊作者：王峻，女，主任醫(yī)師，研究方向：常見惡性腫瘤的早期診斷、化療、熱療、細胞免疫治療、癌痛的規(guī)范化診治、晚期腫瘤的姑息治療及舒緩治療，E-mail：madamwangjun@163.com

基金項目：作者單位： 210024江蘇南京，江蘇省老年醫(yī)院血液腫瘤科;第一作者： 孟麗娟，女，副主任醫(yī)師，研究方向：常見腫瘤的早期診斷、治療，含惡性腫瘤在內的慢性病健康管理，E-mail：hellomlj@126.com