李萬紅

海安縣中醫(yī)院，江蘇 海安 226600

五藤膠囊由雞血藤、青風(fēng)藤、海風(fēng)藤、石楠藤、絡(luò)石藤、補(bǔ)骨脂等藥物組成，具有祛風(fēng)通絡(luò)、溫經(jīng)壯骨功效，對(duì)各類關(guān)節(jié)疾病有良好的治療效果。本文采用薄層色譜法對(duì)雞血藤［1-2］、青風(fēng)藤［3］、補(bǔ)骨脂等進(jìn)行定性鑒別［4］，并采用HPLC法對(duì)五藤膠囊內(nèi)容物中補(bǔ)骨脂素進(jìn)行定量分析，為本品的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 薄層色譜定性鑒別

1.1 材料 雞血藤、海風(fēng)藤、補(bǔ)骨脂、威靈仙等(購自南通三越中藥飲片有限公司，經(jīng)陳峰生主任中藥師鑒定)；五藤膠囊 (海安縣中醫(yī)院，批號(hào)：111228，120420，120711)；芒丙花素、青藤堿、補(bǔ)骨脂素(供定性鑒別用，購自中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 儀器 PBQ-Ⅰ型自動(dòng)鋪板器(重慶南岸動(dòng)力儀器廠)，HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋 (常州國華電器有限公司)，紫外透射反射儀(北京六一儀器廠)，數(shù)碼相機(jī)(英國)，KQ-500超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)等。

1.3 試劑 正己烷、石油醚(60～90℃)、無水乙醇、正丁醇、甲苯、苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醚、三氯甲烷、碘化鉍鉀、亞硝酸鈉等，均為分析純。

1.4 薄層板的制備

1.4.1 硅膠G CMC-Na板的制備 取硅膠G75g，加0.5%CMC-Na溶液180mL，調(diào)成糊狀，用自動(dòng)鋪板器鋪成4mm厚薄板，置水平桌面上通風(fēng)陰干后，110℃活化30分鐘，備用。

1.4.2 氫氧化鈉-硅膠G板的制備 取硅膠G 60 g，加入含2%氫氧化鈉的0.5%CMC-Na溶液150mL，調(diào)成糊狀，用自動(dòng)鋪板器鋪成4mm厚的薄層板，置水平桌面上通風(fēng)晾干后，110℃活化30分鐘，備用。

1.5 薄層色譜鑒別［5］

1.5.1 雞血藤

1.5.1.1 對(duì)照品溶液的配制 取芒丙花素對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.5.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末1 g，加入乙醇100mL，加熱回流1小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，加入1 g硅膠拌勻，揮干溶劑，置硅膠柱中(2 g，內(nèi)徑 1.0 cm，100～200目，干法裝柱)，依次使用石油醚(60～90℃)30mL、甲醇-三氯甲烷(1∶9)40mL洗脫，收集甲醇-三氯甲烷(1∶9)洗脫液，蒸干，殘?jiān)?.5mL三氯甲烷使溶解，作為供試品溶液。

1.5.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備 取雞血藤藥材1 g，同上述供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。

1.5.1.3 陰性供試品溶液的制備 據(jù)處方比例量，取除雞血藤外的其余藥味按工藝要求制成缺雞血藤的樣品，按供試品溶液制備方法，制備陰性供試品溶液。

1.5.1.4 點(diǎn)樣、展開 照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液10μL、對(duì)照品溶液5μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(20∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。

1.5.1.4 顯色與結(jié)果 置紫外光燈 (254 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。

圖1 雞血藤TLC鑒別圖譜

1.5.2 青風(fēng)藤

1.5.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取青藤堿對(duì)照品，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.5.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末2 g，加乙醇25mL，加熱回流1小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。

1.5.2.3 對(duì)照藥材溶液的制備 取青風(fēng)藤藥材粉末約1 g，依上述供試品溶液制備方法制備藥材對(duì)照液。

1.5.2.4 陰性供試品溶液的制備 據(jù)處方比例量，取除青風(fēng)藤外的其余藥味按工藝要求制成缺青風(fēng)藤的樣品，按供試品溶液制備方法，制備陰性供試品溶液。

1.5.2.5 點(diǎn)樣、展開 照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一用2%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯 -甲醇 -水(2∶4∶2∶1)10℃以下放置的上層溶液為展開劑，置濃氨試液預(yù)飽和20分鐘的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干。

1.5.2.6 顯色與結(jié)果 依次噴以碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖2。

圖2 青風(fēng)藤TLC鑒別圖譜

1.5.3 補(bǔ)骨脂

1.5.3.1 對(duì)照品溶液的制備 取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.5.3.2 供試品溶液的制備 取本品藥粉5 g，加石油醚(60～90℃)50mL，回流 30分鐘，濾過，取藥渣揮去石油醚，加乙酸乙酯50mL，回流30分鐘，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。

1.5.3.3 對(duì)照藥材溶液的制備 取補(bǔ)骨脂藥材粉末約0.5 g，加乙酸乙酯20mL，超聲處理15分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

1.5.3.4 陰性供試品溶液的制備 據(jù)處方比例量，取除補(bǔ)骨脂外的其余藥味按工藝要求制成缺補(bǔ)骨脂的樣品，按供試品溶液制備方法，制備陰性供試品溶液。

1.5.3.5 點(diǎn)樣、展開 照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。

1.5.3.6 顯色與結(jié)果 噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)白色熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖3。

圖3 補(bǔ)骨脂TLC鑒別圖譜

2 補(bǔ)骨脂素的含量測定

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)儀器 五藤膠囊(海安縣中醫(yī)院，批號(hào)：111228，120420，120711)；補(bǔ)骨脂素對(duì)照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110766-200414)；甲醇、乙腈(色譜純)，超純水(自制)，其余試劑均為分析純。Agi lent 1100高效液相色譜儀；VWD紫外檢測器；AET-40SM型1/10萬電子天平(日本Shimad公司)；UV-2401型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。

2.2 色譜條件 色譜柱：Kromasi l C18柱 (250×4.6 mm)；流動(dòng)相的選擇；經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，以甲醇-乙腈-1%乙酸(15∶25∶60)作為流動(dòng)相，測定波長為246 nm，補(bǔ)骨脂素峰與雜質(zhì)峰分離度較好。流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；靈敏度：AUFS=1.0。系統(tǒng)試驗(yàn)適應(yīng)性研究：在上述條件下測定樣品中補(bǔ)骨脂素的含量，以補(bǔ)骨脂素峰計(jì)算理論板數(shù)應(yīng)不低于3 000。

2.3 對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定補(bǔ)骨脂素對(duì)照品0.294mg，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得濃度為29.40μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取五藤膠囊內(nèi)容物適量，精密稱定約0.5 g，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取2小時(shí)，放冷，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，作為供試品溶液。

2.3.3 陰性供試品溶液的制備 據(jù)處方比例量，取除補(bǔ)骨脂外的其余藥味按工藝要求制成缺補(bǔ)骨脂的陰性供試品，再按供試品溶液制備方法，制備陰性供試品溶液。

2.4 空白試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液、供試品溶液各10μL注入液相色譜儀。結(jié)果表明處方中其它藥材對(duì)補(bǔ)骨脂素測定無干擾。結(jié)果見圖4—6。

圖4 補(bǔ)骨脂素對(duì)照品HPLC色譜圖

圖5 補(bǔ)骨脂陰性供試品HPLC色譜圖

圖6 五藤膠囊中補(bǔ)骨脂素的HPLC色譜圖

2.5 補(bǔ)骨脂素線性關(guān)系考察 精密稱取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品7.35 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得補(bǔ)骨脂素對(duì)照品儲(chǔ)備液（濃度為294μg/mL）。再依次分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.4、1、1.6、2.2、2.8mL置 10mL容量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，即得濃度為11.76、29.40、47.04、64.68、82.32μg/mL的對(duì)照品溶液。依次吸取上述對(duì)照品溶液各20μL進(jìn)樣，測定峰面積。以進(jìn)樣補(bǔ)骨脂素質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以峰面積的積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)注曲線，回歸方程為 y=42.194x+0.408，r=0.999 9，線性范圍：11.76～82.32μg/mL。結(jié)果見表1與圖7。

表1 補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定數(shù)據(jù)

圖7 補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取的補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液（濃度為 47.04μg/mL）20μL，重復(fù)進(jìn)樣 6次，測得峰面積，計(jì)算RSD值為1.03%。結(jié)果見表2。

表2 補(bǔ)骨脂素精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液每隔一段時(shí)間進(jìn)樣1次，每次20μL，測定峰面積，結(jié)果表明樣品溶液在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表3。

表3 補(bǔ)骨脂素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為120420的膠囊，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，平行試驗(yàn)6份，進(jìn)樣20μL，測定峰面積，結(jié)果見表4。

表4 補(bǔ)骨脂素重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知補(bǔ)骨脂素含量為3.62 mg/g的五藤膠囊(批號(hào)：120420)粉末5份，每份約80mg，分別加入濃度為29.4μg/mL的補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)溶液 8、8、10、10、15mL，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測定峰面積。平均回收率為99.75%，RSD值為1.09%。結(jié)果見表5。

2.10 樣品含量測定 分別精密稱取3個(gè)批號(hào)五藤膠囊的內(nèi)容物，每份約0.5 g，按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣20μL，依法測定，結(jié)果見表6。

根據(jù)測定結(jié)果，暫定五藤膠囊內(nèi)容物中補(bǔ)骨脂素含量不得低于3mg/g。

表5 補(bǔ)骨脂素回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 樣品中補(bǔ)骨脂素含量測定結(jié)果

3 討論

五藤膠囊以雞血藤、青風(fēng)藤、海風(fēng)藤、石楠藤、絡(luò)石藤等5味莖(藤)木類中藥為主藥，共奏祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、蠲痹痛之功，具抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制作用；制川烏、制草烏、干姜、細(xì)辛祛風(fēng)通絡(luò)，溫經(jīng)止痛，亦具抗炎、免疫作用；豨薟草、威靈仙祛風(fēng)化濕；全蝎、僵蠶、烏梢蛇熄風(fēng)止痙，祛風(fēng)活血，能輔助主藥增強(qiáng)祛風(fēng)通絡(luò)作用；生地黃性味甘寒，可抑制諸藥燥熱之性，生地黃本身也具有抗炎和促進(jìn)免疫作用；鹿角霜、補(bǔ)骨脂溫腎助陽兼治因風(fēng)濕性疾病引起的骨代謝紊亂。諸藥合用具有祛風(fēng)通絡(luò)、溫經(jīng)壯骨的功效，可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎等，尤其用于治療強(qiáng)直性脊柱炎取得令人滿意的效果［6］。

對(duì)五藤膠囊的主要成份用薄層色譜定性鑒別和采用HPLC法對(duì)膠囊內(nèi)容物主要指標(biāo)成份進(jìn)行定量分析。方法先進(jìn)，重現(xiàn)性、可行性好［7-8］，為五藤膠囊的質(zhì)量控制提供依據(jù)。本方經(jīng)本院臨床使用，療效確切，深受患者歡迎。本品其他組份的定性定量分析方法有待進(jìn)一探討。

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