楊潤霞，吳潤，劉磊，寇曉晶，魏姣 ，王玉龍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州　730046)

三種中藥復(fù)方制劑對雛雞免疫器官發(fā)育及免疫功能的影響

楊潤霞1，吳潤1，劉磊1，寇曉晶2，魏姣1，王玉龍1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州730046)

摘要：為了探究中藥復(fù)方對雛雞免疫功能及免疫器官發(fā)育的影響.試驗(yàn)以黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、黃芩和五倍子等單味中藥組成3種中藥復(fù)方制劑，將120只1日齡健康雛雞分為4組(Ⅰ組，“扶正止泄散”，未加玉屏風(fēng)散基礎(chǔ)復(fù)方組；Ⅱ組，“扶正止泄散”復(fù)方組；Ⅲ組，“芪術(shù)扶正湯”復(fù)方組；Ⅳ組，對照，不加喂藥)，分別于42、52和62日齡對試驗(yàn)組和對照組雞進(jìn)行檢測，測定T淋巴細(xì)胞、雞γ-干擾素、抗體效價和免疫器官指數(shù)等免疫指標(biāo)，同時制作組織切片、HE染色，觀察其對雛雞內(nèi)臟器官發(fā)育的影響.結(jié)果表明：試驗(yàn)組T淋巴細(xì)胞ANAE陽性率、抗體效價和γ-IFN水平顯著升高(P<0.01)，Ⅰ、Ⅱ組優(yōu)于Ⅲ組；免疫器官指數(shù)和血細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組(P<0.01或P<0.05)，Ⅱ組優(yōu)于Ⅰ組；鏡下觀察組織切片，各器官結(jié)構(gòu)良好無明顯病變.3種中藥復(fù)方對雛雞免疫功能具有正向促進(jìn)作用，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞及體液免疫功能，其中Ⅱ組具有明顯優(yōu)勢.

關(guān)鍵詞：雛雞；中藥復(fù)方制劑；免疫功能；器官發(fā)育；組織切片

第一作者：楊潤霞(1988-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué).E-mail：834035123@qq.com

中草藥不僅能提高畜禽生長性能，增強(qiáng)或調(diào)節(jié)雞體細(xì)胞免疫和體液免疫功能[1]，對疾病防治也有一定效果[2,3]，而且因其藥性溫和、耐藥性低、毒副作用小，且具有雙向調(diào)節(jié)等優(yōu)勢已成為動醫(yī)免疫增強(qiáng)劑發(fā)展的方向[4].據(jù)此，本研究利用我國豐富的天然中草藥，依據(jù)中獸醫(yī)學(xué)理論，將所選中草藥組方配伍，通過對42、52、62日齡肉仔雞飼喂試驗(yàn)，比較3種中草藥復(fù)方對肉仔雞免疫功能的影響，明確3種中草藥復(fù)方對肉仔雞免疫器官發(fā)育的影響，為中草藥復(fù)方制劑的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1材料與方法

1.1　試驗(yàn)藥品及試劑

淋巴細(xì)胞分層液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司生產(chǎn))，雞新城疫活疫苗(廣西麗原生物股份有限公司生產(chǎn)，批號為131104)，雞新城疫Ⅳ系苗(Lasota，500羽/瓶)，小牛血清(浙江三利生物制品廠，批號20120301)，雞γ干擾素(IFN-γ)、酶聯(lián)免疫試劑盒(上海裕平生物科技有限公司生產(chǎn)),2% α-醋酸萘酯液、1%孔雀綠染色液、瑞氏姬姆薩染色液、2%SPA菌體試劑、4%甲醛溶液等.

中藥復(fù)方制劑的制備參照文獻(xiàn)[5].

1.2　動物分組與試驗(yàn)

將120只1日齡雛雞隨機(jī)分為4組，每組30只進(jìn)行常規(guī)飼喂，各組分別于12和32日齡免疫Ⅴ系Lasota新城疫疫苗，18日齡免疫傳染性法氏囊疫苗.Ⅰ組為“扶正止瀉散”基礎(chǔ)復(fù)方組，即未加“玉屏風(fēng)散”；Ⅱ組為“扶正止瀉散”復(fù)方組；Ⅲ組為“芪術(shù)扶正湯”復(fù)方組；IV組為不喂藥的對照組.各組均在相同環(huán)境下飼養(yǎng)62 d.3個試驗(yàn)組喂藥方法：試驗(yàn)組分別在31、43、55日齡經(jīng)飲水飼喂藥，每次連續(xù)飼喂5 d停藥7 d.各組分別于42、52、62日齡進(jìn)行3次檢測.同時采取心臟、脾臟、法氏囊等器官置4%甲醛溶液中固定，用于制作切片.

1.3　檢測指標(biāo)及方法

1.3.1細(xì)胞免疫檢測指標(biāo) T淋巴細(xì)胞計數(shù)：應(yīng)用α-醋酸萘酯酶染色(ANAE)方法，無菌采抗凝血5 mL于離心管中，提取淋巴細(xì)胞層，加入適量Hank’s液配制成含有細(xì)胞數(shù)為2~5×106/mL的淋巴細(xì)胞懸液.將稀釋好的淋巴細(xì)胞液涂片，置于2.5%戊二醛中固定，沖洗10 min后再置于孵育液中，37 ℃染色3 h，沖洗后用1%孔雀綠復(fù)染30 s，沖洗，干燥.油鏡下鏡檢，計數(shù)200個淋巴細(xì)胞，胞漿內(nèi)有紅色或紫色顆粒團(tuán)塊者，為α-醋酸奈脂陽性細(xì)胞，即T淋巴細(xì)胞.

中性粒細(xì)胞吞噬試驗(yàn)：將2%SPA 0.1 mL菌體試劑加入到試管內(nèi)的2 mL的抗凝血中，混勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)30 min，每隔10 min搖動1次試管，搖動2次，最后1次不搖.吸取白細(xì)胞層，滴于載玻片上，推片，干燥后瑞氏染色，置于油鏡下鏡檢，視野中隨機(jī)選取200個中性粒細(xì)胞，記錄吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)和被吞噬細(xì)菌數(shù)，按下列公式計算出吞噬率和吞噬指數(shù)：

雞γ-干擾素的測定：用ELISA方法對雛雞γ-干擾素測定.

血常規(guī)檢查：白細(xì)胞、紅細(xì)胞計數(shù)和淋巴細(xì)胞比例均按安麗英[6]所述家禽血液直接染色計數(shù)法計數(shù).

1.3.2體液免疫檢測指標(biāo)B淋巴細(xì)胞計數(shù)：取抗凝血1 mL，加入淋巴細(xì)胞分層液，提取淋巴細(xì)胞層，加入Hank’s液混勻后配制成含有細(xì)胞數(shù)為(2~5)×106/mL的淋巴細(xì)胞懸液.取上述懸液0.5 mL，加入0.5 mL 0.1%SPA菌體試劑，混勻后放置于4 ℃冰箱內(nèi)30 min，5%小牛血清-Hank’s液(37 ℃預(yù)熱)洗滌2次，棄上清，取剩余混懸液1滴推片，瑞氏-姬姆薩染液染色鏡檢.凡是淋巴細(xì)胞表面粘附有5個以上菌體的細(xì)胞即為B淋巴細(xì)胞.每份標(biāo)本必須計算不少于200個淋巴細(xì)胞，并計算出B淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分率.

抗體效價測定：采2只健康成年公雞新鮮血液，立即放入生理鹽水中洗滌3次，離心后，按1∶1吸取兩只公雞紅細(xì)胞，配成1%紅細(xì)胞懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用，新城疫血凝(HA)及血凝抑制試驗(yàn)(HI)參照文獻(xiàn)[6].

免疫器官指數(shù)的測定： 于42、55和62日齡時各組中隨機(jī)抽取10只雞，屠宰并摘取胸腺、脾臟、法氏囊，稱質(zhì)量，計算器官指數(shù).公式如下：

器官指數(shù)=器官質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(kg)

1.3.3組織切片制備方法取出4%甲醛溶液中固定好的組織塊，按組織切片制作方法依次進(jìn)行脫水、透明、包埋制作石蠟切片，HE染色后顯微鏡下觀察.

2結(jié)果與分析

2.1　三種中藥復(fù)方對T淋巴細(xì)胞數(shù)量及γ-干擾素水平的影響

由表1可知，各齡Ⅰ、Ⅱ組T淋巴細(xì)胞數(shù)量、γ-干擾素水平與對照組比較均差異極顯著(P<0.01)，Ⅲ組42、52日齡淋巴細(xì)胞數(shù)量與對照組比較差異顯著(P<0.05)，γ-干擾素水平與對照組比較差異極顯著(P<0.01)；62日齡時T淋巴細(xì)胞數(shù)量與對照組比較差異不顯著(P>0.05)，γ-干擾素水平與對照組比較差異顯著(P<0.05).

2.2　三種中藥復(fù)方對雛雞中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)的影響

由表2可知，42日齡時，Ⅰ、Ⅱ組吞噬率與對照組(Ⅳ組)比較，差異極顯著(P<0.01)，Ⅲ組與Ⅳ組比較，差異不顯著(P>0.05)，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組吞噬指數(shù)與Ⅳ組比較，差異極顯著(P<0.01)；52日齡時，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組吞噬率及吞噬指數(shù)與對照組組比較，均差異極顯著(P<0.01)；62日齡時，Ⅰ、Ⅱ組與Ⅳ組比較，吞噬率及吞噬指數(shù)均差異極顯著(P<0.01)，而Ⅲ組吞噬率與對照組比較，差異不顯著(P>0.05)，Ⅲ組吞噬指數(shù)與對照組差異顯著(P<0.05).

表1　三種中藥復(fù)方對雛雞T淋巴細(xì)胞ANAE陽性率及γ-干擾素水平的影響結(jié)果

表2　三種中藥復(fù)方對雛雞中性粒細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)的影響

2.3　三種中藥復(fù)方對雞血細(xì)胞數(shù)量的影響

由表3可知，42日齡時，Ⅰ和Ⅱ組RBC、WBC及淋巴細(xì)胞數(shù)與對照組比較差異極顯著(P<0.01)，Ⅲ組RBC、WBC與對照組比較差異不顯著(P>0.05)，而淋巴細(xì)胞數(shù)量與對照組比較差異極顯著；52日齡時，Ⅰ、Ⅱ組RBC、WBC及淋巴細(xì)胞數(shù)與Ⅳ組比較，差異極顯著(P<0.01)，Ⅲ組RBC數(shù)量與對照組比較差異顯著(P<0.05)，而WBC及淋巴細(xì)胞數(shù)量與對照組比較差異極顯著(P<0.01)；62日齡時，Ⅰ組、Ⅲ組WBC及淋巴細(xì)胞數(shù)量與對照組比較差異顯著，而RBC數(shù)與對照組差異不顯著(P>0.05).

表3　三種中藥復(fù)方對雛雞不同日齡血細(xì)胞數(shù)量的影響

2.4　三種中藥復(fù)方對雛雞SmIg陽性B淋巴細(xì)胞數(shù)及抗體效價的影響

由表4可知：42日齡時，Ⅰ、Ⅱ組B淋巴細(xì)胞陽性率與對照組比較差異極顯著(P<0.01)，而Ⅲ組與對照組組比較差異顯著(P<0.05)；Ⅱ組抗體效價與對照組組比較差異極顯著(P<0.01)，而Ⅰ、Ⅲ組與對照組比較差異不顯著(P>0.05).52日齡時，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組B淋巴細(xì)胞陽性率與對照組比較差異極顯著(P<0.01)；Ⅰ、Ⅱ組抗體效價與對照組比較差異極顯著(P<0.01)，而Ⅲ組與對照組比較差異不顯著(P>0.05).62日齡時，Ⅰ、Ⅱ組B淋巴細(xì)胞陽性與對照組組比較差異極顯著(P<0.01)，Ⅲ組與對照組比較差異顯著(P<0.05)；Ⅱ組抗體效價與對照組比較差異極顯著(P<0.01)，而Ⅰ、Ⅲ組與對照組比較，差異不顯著(P>0.05).表明Ⅱ組能顯著增加B淋巴細(xì)胞陽性率及抗體效價，說明此組方能提高雞體液免疫功能.

表4　三種中藥復(fù)方對雛雞SmIg陽性B淋巴細(xì)胞數(shù)及抗體效價的影響

2.5　三種中藥復(fù)方對免疫器官指數(shù)的影響

由表5可知：42日齡時，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組胸腺、法氏囊、脾臟指數(shù)與對照組比較，差異極顯著(P<0.01)；52日齡時，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組胸腺、法氏囊指數(shù)與對照組比較，差異極顯著(P<0.01)，Ⅰ組、Ⅱ組脾臟指數(shù)與對照組比較差異極顯著(P<0.01)，而Ⅲ組脾臟指數(shù)與對照組比較差異顯著(P<0.05)；62日齡時，Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組法氏囊、脾臟指數(shù)與對照組比較差異極顯著(P<0.01)，Ⅱ組、Ⅲ組胸腺指數(shù)與對照組比較差異極顯著(P<0.01)，而Ⅰ組胸腺指數(shù)與對照組比較差異顯著(P<0.05).

2.6　三種中藥復(fù)方對雛雞組織學(xué)的影響

肝臟：肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞及胞核完整，肝板及肝血竇無明顯炎性反應(yīng)；法氏囊：結(jié)構(gòu)清晰，淋巴細(xì)胞核完整，無明顯病變；脾臟：脾臟結(jié)構(gòu)完整，無明顯病變，紅髓區(qū)與白髓區(qū)分界明顯，淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；心臟：心肌纖維結(jié)構(gòu)完整，胞核結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維無炎性反應(yīng).

表5　三種中藥復(fù)方對雛雞免疫器官指數(shù)的影響

A:肝臟； B：法氏囊；C：脾臟；D：心臟.圖1　雛雞的組織學(xué)變化Fig.1　Histological changes of chicken

3討論

3.1　中藥復(fù)方對雛雞免疫功能的影響

根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究，白術(shù)、黃芪、黨參、防風(fēng)等中藥中均含有大量的多糖等生物有效成分，它們能快速活化機(jī)體免疫系統(tǒng)，增加免疫活性細(xì)胞的數(shù)量并增強(qiáng)其功效[7-8].楊麗平等[9]報道，石榴皮能提高抗體效價.胡元亮等[10]報道，黃芪、黨參等中藥能提高ND抗體效價，延長其在體內(nèi)的存留時間.胡曉蕾等[11]報道，中草藥白術(shù)能夠增強(qiáng)脾臟的功能，并提高T、B淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化的能力.高鴻霞等[12]報道，防風(fēng)可明顯提高LPS誘導(dǎo)的脾T、B細(xì)胞增殖.Kim等[13]研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ能顯著增強(qiáng)抗原特異T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng).因此，本研究選用黃芪、白術(shù)、防風(fēng)等中草藥配伍組方飼喂實(shí)驗(yàn)組雞，通過對不同日齡試驗(yàn)組雞體液免疫和細(xì)胞免疫指標(biāo)的檢測，發(fā)現(xiàn)3種組方胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著高于對照組，表明3種中藥復(fù)方均能顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，而且Ⅱ組(扶正止瀉散組)抗體效價、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化等方面顯著高于其他2組[14].

3.2　中藥復(fù)方對雛雞免疫器官及的其他組織發(fā)育的影響

胸腺、法氏囊和脾臟是禽類最重要的免疫器官，其發(fā)育狀態(tài)及機(jī)能強(qiáng)弱直接決定著禽類的免疫水平[15-16].Rivas 等[17]指出，胸腺、法氏囊和脾臟的質(zhì)量可用于評價雛雞的免疫狀況.同時有學(xué)者認(rèn)為免疫器官指數(shù)降低為免疫抑制所致，而其指數(shù)增加則為免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)[18].本試驗(yàn)結(jié)果顯示，3個中藥復(fù)方對雛雞免疫器官組織結(jié)構(gòu)清晰，胸腺、法氏囊發(fā)育良好，無明顯衰老癥狀，這與仇微紅等[19-20]的研究結(jié)果相似，提示3種中藥復(fù)方具有延緩胸腺、脾臟和法氏囊退化的功效.

3.3　中藥復(fù)方在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用前景

本研究檢測結(jié)果顯示：Ⅰ組(扶正止瀉散基礎(chǔ)方組)和Ⅱ組(扶正止瀉散組)在不同日齡時的細(xì)胞免疫和體液免疫各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于對照組(P<0.01)，而Ⅲ組(芪術(shù)扶正湯)與對照組差異顯著(P<0.05)，提示中草藥及其主要活性成分具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能，能多靶點(diǎn)、多途徑、多水平地調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能.同時因中草藥具有天然安全、資源豐富的特點(diǎn)，常被用作保健食品和藥品用于防治腫瘤或免疫性相關(guān)的疾病，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)劑的作用[21].但目前它們免疫調(diào)節(jié)的直接作用靶點(diǎn)及其在體內(nèi)的吸收、分布和藥理作用機(jī)制尚不清楚.因此，深入探索和挖掘中草藥對免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的藥理及作用機(jī)制，將在臨床應(yīng)用和免疫預(yù)防方面都具有重要價值.

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(責(zé)任編輯胡文忠)

Effects of three traditional Chinese medicine prescriptions on the immune organ development and immune function of chicken

YANG Run-xia1,WU Run1,LIU Lei1,KOU Xiao-jing2,WEI Jiao1,WANG Yu-long1

(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China；2.Gansu Animal

Epidemic Disease Control Center,Lanzhou 730046,China)

Abstract：This experiment was carried out to explore the effects of traditional Chinese medicines on the immune function and immune organ development of chicken.Three Chinese herbal medicine compound preparations were made by using Astragalus membranaceus,Atractylodes macrocephala,Saposhnikovia divaricata,Scutellaria baicalensis and gallnut.Meanwhile,120 one-day-old chicks were divided into 4 groups,and detected at the ages of 42,52 and 62 days.The detected immune parameters were T lymphocytes,chicken γ- interferon,antibody titers and immune organ indexes,and the tissue sections and HE staining were also done.The results showed that the T lymphocytes ANAE positive rate,antibody titers and γ-IFN levels of the experimental groups were significantly higher than those of control group(P<0.01),and those of groupsⅠand Ⅱwere higher than those of group Ⅲ.The immune organ indexes and the blood cells number of experimental groups were significantly higher than those of control group(P<0.01 or P<0.05),and those of groupⅡ were higher than those of groupⅠ.The observation results of tissue sections showed that each organ structure without obvious lesions.The experiment indicated that three Chinese herbal medicine compound preparations had positive effects on immune function of chicken,and could improve the immune function of body's cell and humor,and the effects of groupⅡ was the most obviously.

Key words：chicken;Chinese herbal compound;immunologic function;organ development;tissue sections

收稿日期：2014-09-03；修回日期：2014-10-15

基金項(xiàng)目：甘肅省農(nóng)業(yè)科技專項(xiàng)農(nóng)業(yè)科技示范基地建設(shè)項(xiàng)目“中草藥抗畜禽常見傳染病作用的研究與應(yīng)用”(0623006).

通信作者：吳潤，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)的研究與教學(xué)工作.E-mail：wurun@gsau.edu.cn

中圖分類號：S 853

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)04-0028-06