豆艷麗，吳潤，劉磊，錢續(xù)

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.榆中縣畜牧水產(chǎn)技術(shù)推廣中心,甘肅 榆中　730100)

十三種中藥水煎液體外抗雞新城疫病毒的研究

豆艷麗1,2，吳潤1，劉磊1，錢續(xù)2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.榆中縣畜牧水產(chǎn)技術(shù)推廣中心,甘肅 榆中730100)

摘要：雞新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)是危害家禽生產(chǎn)的重要病毒之一.試驗選取黃芪、紫胡、金銀花、野菊花、黃芩、藿香、蘆根、細(xì)辛、梔子、甘草、馬鞭草、魚腥草、大青葉13種中藥的提取液在傳代細(xì)胞系雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)上進行抗NDV試驗，通過細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)和噻唑藍活細(xì)胞染色法(MTT)，檢測13種中藥提取液分別對正常DF-1的細(xì)胞毒性以及NDV感染DF-1細(xì)胞的預(yù)防、治療和直接滅活作用.結(jié)果表明：黃芪、野菊花、馬鞭草和細(xì)辛提取液對NDV有顯著地直接滅活作用；黃芪、金銀花、野菊花和細(xì)辛提取液有顯著的阻斷NDV吸附作用；黃芪、金銀花、野菊花和馬鞭草提取液具有顯著抑制NDV生物合成作用；綜合以上結(jié)果說明黃芪、金銀花、野菊花、馬鞭草和細(xì)辛提取液的抗NDV作用較好.為抗NDV中藥研究和臨床用藥提供了相關(guān)的試驗數(shù)據(jù).

關(guān)鍵詞：雞新城疫病毒；中藥；給藥模式；抑制作用；

第一作者：豆艷麗(1987-)，女，碩士研究生，主要從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作.E-mail:douyl@126.com

雞新城疫(Newcastle disease,ND)是由雞新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病，是目前危害我國養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一[1]，臨床防治無特效藥物[2]，主要以免疫接種和緊急接種防控為主.中藥作為天然產(chǎn)物，保持了各種成分的自然性和生物活性，在動物體內(nèi)易吸收易代謝，具有誘生干擾素、抗病毒、增強機體免疫力的功效[3-4]，因此，中藥成為當(dāng)前生產(chǎn)綠色動物食品的有益添加劑和防治畜禽疾病的首選藥物.鑒于此，本研究選取臨床抗呼吸道病毒有較好作用的中藥，對其體外抗NDV作用進行了研究.通過13種中藥水煎液對感染NDV的傳代細(xì)胞系雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)保護效果的考察，以期評價不同中藥在DF-1上對NDV增殖的抑制作用，為進一步發(fā)掘和研發(fā)高效低毒的抗病毒中藥制劑提供科學(xué)依據(jù).

1材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1病毒與細(xì)胞NDV由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院微生物實驗室保存，接種10日齡雞胚復(fù)壯病毒，收集病毒液-20 ℃保存；雞胚成纖維細(xì)胞系(DF-1)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所提供.

1.1.2中藥黃芪(Radixastragali)、柴胡(Bupleurichinensis)、金銀花(Loniceraejaponica)、野菊花(Dendranthemaindicum)、黃芩(Scutellariabaicalensis)、藿香(Agastacherugosa)、蘆根(Rhizomaphragmitis)、大青葉(Isatidisindigotica)、細(xì)辛(Asarumsieboldii)、梔子(Gradeniaejasminoides)、甘草(Glycyrrhizaeuralensis)、馬鞭草(Verbenaeoffcinalis)、魚腥草(Houttyniacordata)，購自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院楊致禮副教授鑒定.

1.1.3細(xì)胞培養(yǎng)液犢牛血清(FBS)、DMEM、青霉素(800 000 IU)、鏈霉素(1 600 000 IU)、胰酶、MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)；D-Hanks、0.25%胰酶、雙抗配制方法參照文獻[1].細(xì)胞完全培養(yǎng)液：含10% FBS、1%雙抗(10 000 IU/mL)DMEM營養(yǎng)液；細(xì)胞維持液：含2% FBS、1%雙抗(10 000 IU/mL)DMEM營養(yǎng)液.

1.2　試驗方法

1.2.1中藥提取液的制備稱取13種中藥各1 g，分別放入小燒杯(100 mL)中，加20倍體積的雙蒸水，浸泡30 min，加熱至沸騰后文火煎煮15 min，濾紙過濾除去沉渣，如此反復(fù)3次，合并濾液，濃縮至10 mL(即1 mL水提液相當(dāng)于含生藥量0.1 g)，115 ℃高壓滅菌20 min.13種中藥水煎液均4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.2中藥對DF-1細(xì)胞毒性的測定用細(xì)胞維持液將中藥藥液遞倍稀釋成10個梯度，即100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.20 mg/mL，接種至已經(jīng)長成單層DF-1細(xì)胞的96孔細(xì)胞板上，接種量為100 μL/孔，每質(zhì)量濃度重復(fù)4孔，補加細(xì)胞維持液100 μL，并設(shè)細(xì)胞對照組和中藥對照組.置于5% CO2、37 ℃溫箱中培養(yǎng)72 h，每日觀察感染細(xì)胞圓縮、脫落等細(xì)胞病變(Cytopathic effect,CPE)，確定細(xì)胞不出現(xiàn)CPE的最低稀釋倍數(shù)為受試中藥的最大安全濃度(TC0).

1.2.3NDV的毒力測定采用微量細(xì)胞培養(yǎng)法測定半數(shù)細(xì)胞感染劑量(TCID50)，對病毒液進行10倍梯度稀釋，接種于長滿單層DF-1細(xì)胞的96孔細(xì)胞板上，每孔100 μL，每質(zhì)量濃度重復(fù)8孔，同時設(shè)病毒對照和細(xì)胞對照.37 ℃孵育1 h后補加維持液100 μL，置5% CO2、37 ℃溫箱72 h，逐日觀察CPE，以72 h CPE達50%以上病變的孔為陽性孔，記錄發(fā)生CPE和未發(fā)生CPE的孔數(shù)，按照Reed-Muench法[1]計算病毒的TCID50.

1.2.4中藥體外抗NDV試驗

1.2.4.1中藥對NDV的直接滅活作用以中藥TC0為起點，藥液遞倍稀釋成10個梯度，將上述不同質(zhì)量濃度的藥液與100TCID50的NDV病毒液(體積比：1∶1)混合后37 ℃作用1 h，接種于長滿單層DF-1細(xì)胞的96孔細(xì)胞板上，每孔200 μL，每質(zhì)量濃度重復(fù)4孔，并設(shè)病毒對照(只加200 μL100TCID50的NDV病毒液)和細(xì)胞對照(只加200 μL的細(xì)胞維持液)，置于5%CO2、37 ℃溫箱培養(yǎng)72 h.

1.2.4.2中藥對NDV吸附細(xì)胞的阻斷作用依據(jù)1.2.4.1方法稀釋藥液，將不同質(zhì)量濃度的藥液加入已長滿單層DF-1細(xì)胞的96孔細(xì)胞板上，每孔100 μL，每質(zhì)量濃度重復(fù)4孔，置于5%CO2、37 ℃溫箱孵育1 h，之后以100 μL100TCID50的NDV病毒液攻擊細(xì)胞.并設(shè)病毒對照和細(xì)胞對照，置5%CO2、37 ℃溫箱培養(yǎng)72 h.

1.2.4.3中藥對NDV生物合成的抑制作用將100TCID50的NDV病毒液加入已長滿單層DF-1細(xì)胞的96孔細(xì)胞板上，每孔100 μL，每質(zhì)量濃度重復(fù)4孔，置于5%CO2、37 ℃溫箱孵育1 h，之后補加不同質(zhì)量濃度的藥液100 μL.并設(shè)病毒對照和細(xì)胞對照，置5%CO2、37 ℃溫箱培養(yǎng)72 h.

1.2.4.4評判方法采用MTT活細(xì)胞染色法[5]，選擇630 nm波長酶標(biāo)檢測儀測定各孔吸光度(D630)，同時設(shè)中藥顏色對照組，二者之差即為實際活細(xì)胞D630值.經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析中藥的最小有效濃度，并以抑制指數(shù)(inhibition index,TI)為標(biāo)準(zhǔn)衡量中藥對病毒的抑制效力，TI值越大，中藥抑制病毒的作用越強[6].

抑制指數(shù)(TI)=最大無毒質(zhì)量濃度/最小有效質(zhì)量濃度

2結(jié)果與分析

2.1　中藥對DF-1細(xì)胞的毒性作用

在受試期間內(nèi)，正常對照細(xì)胞孔形態(tài)正常，中藥組對細(xì)胞具有毒性，質(zhì)量濃度越大細(xì)胞毒性越強，引起細(xì)胞皺縮、融合、脫落，不同中藥所致的細(xì)胞毒性存在差異，藿香、蘆根、細(xì)辛、馬鞭草對DF-1的毒性最小，TC0均為25 mg/mL；黃芪、柴胡、金銀花、黃芩、大青葉、梔子、魚腥草的TC0均為6.25 mg/mL，野菊花、甘草的TC0均為12.5 mg/mL.

2.2　NDV的TCID5 0測定

根據(jù)NDV所致CPE陽性孔和陰性孔的數(shù)目，按照Reed-Muench法計算NDV的感染效價(TCID50)，測得TCID50為10-6.5/0.1mL.

2.3　不同中藥的體外抗病毒作用

2.3.1中藥對NDV的直接滅活作用受試時間內(nèi)正常對照細(xì)胞形態(tài)均正常，MTT檢測結(jié)果見表1.中藥水煎液質(zhì)量濃度越大，對NDV的直接滅活作用越強，其中黃芪、野菊花、馬鞭草、細(xì)辛對NDV的直接滅活作用最強，有效抑制質(zhì)量濃度為1/16TC0(P<0.05或P<0.01)，TI為16；金銀花、黃芩對NDV的直接滅活作用次之，有效抑制質(zhì)量濃度為1/8TC0(P<0.05或P<0.01)，TI為8；柴胡、藿香、蘆根、甘草對NDV的直接滅活作用較弱，有效抑制質(zhì)量濃度為1/4TC0(P<0.05或P<0.01)，TI為4；其余被試中藥對NDV的抑制作用很弱(TI≤2).

表1　中藥對NDV的直接滅活作用(n=13)

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母者表示差異顯著(P<0.05)；與病毒對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01).

2.3.2中藥對NDV吸附細(xì)胞的阻斷作用受試時間內(nèi)正常對照細(xì)胞形態(tài)均正常，MTT檢測結(jié)果見表2.中藥水煎液質(zhì)量濃度越大，對NDV吸附細(xì)胞的阻斷作用越強，黃芪、金銀花、野菊花、細(xì)辛對NDV的阻斷作用最強，有效抑制質(zhì)量濃度為1/16TC0(P<0.05或P<0.01)，TI為16；柴胡、馬鞭草對NDV的阻斷作用次之，有效抑制質(zhì)量濃度為1/8TC0(P<0.05或P<0.01)，TI為8；黃芩、蘆根對NDV的阻斷作用較弱，有效抑制質(zhì)量濃度為1/4TC0(P<0.05或P<0.01)，TI為4；其余被試中藥對NDV的抑制作用很弱(TI≤2).

2.3.3中藥對NDV生物合成的抑制作用受試時間內(nèi)正常對照細(xì)胞形態(tài)均正常，MTT檢測結(jié)果見表3.中藥水煎液質(zhì)量濃度越大，對NDV生物合成的抑制作用越強，黃芪、金銀花、野菊花、馬鞭草對NDV生物合成的抑制作用最強，有效抑制質(zhì)量濃度為1/16TC0(P<0.05或P<0.01)，TI為16；柴胡、藿香、細(xì)辛對NDV的抑制作用次之，有效抑制濃度為1/8TC0(P<0.05或P<0.01)，TI為8；其余被試中藥對NDV的抑制作用很弱(TI≤2).

表2　中藥對NDV吸附細(xì)胞的阻斷作用(n=13)

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母者表示差異顯著(P<0.05)；與病毒對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01).

表3　中藥對NDV合成復(fù)制的阻斷作用(n=13)

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母者表示差異顯著(P<0.05)；與病毒對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01).

3討論

1)MTT活細(xì)胞染色法是體外常用的一種篩選抗病毒中藥的方法，該方法通過測定吸光度(OD)間接反應(yīng)活細(xì)胞存活率，具有靈敏度高、簡便快速的優(yōu)點[7].本研究利用NDV在其種屬來源相同的DF-1傳代細(xì)胞系中更適宜增殖的特性[8]，首先體外培養(yǎng)DF-1傳代細(xì)胞系，通過MTT活細(xì)胞染色法在630nm波長酶標(biāo)檢測儀測定各孔D630，以間接評價各種中藥對NDV的活性，同時試驗組設(shè)定了中藥顏色對照組，數(shù)據(jù)統(tǒng)計時扣除中藥顏色的影響，以準(zhǔn)確評價中藥對NDV的抑制作用[9]，使試驗數(shù)據(jù)更具科學(xué)性.

2)中藥抗病毒的機理較復(fù)雜，主要通過提高免疫細(xì)胞的粘附、誘生干擾素、抑制病毒基因組復(fù)制、保護靶細(xì)胞等途徑來抑制病毒增殖[10-12]，針對此特性試驗設(shè)置了中藥直接滅活病毒、抗病毒吸附和抗病毒生物合成3個試驗組，結(jié)果表明中藥直接滅活NDV作用最強的是黃芪、野菊花、馬鞭草、細(xì)辛，抗NDV吸附作用最強的是黃芪、金銀花、野菊花、細(xì)辛，抗NDV生物合成作用最強的是黃芪、金銀花、野菊花、馬鞭草，可見中藥與NDV的作用方式不同，其有效成分抗病毒活性有差異.有研究表明黃芪多糖(APS)在質(zhì)量濃度為1 000、500 μg/mL具有顯著的抗NDV吸附的作用，在質(zhì)量濃度為125 μg/mL時無抗NDV吸附作用，質(zhì)量濃度為125μg/mL時具有抑制NDV生物合成的作用[13].

3)中藥抗病毒的基本原理是扶正祛邪，其有效成分通過抑制病毒增殖的某一環(huán)節(jié)或增強機體的免疫力來發(fā)揮作用.近年來，對中藥抗病毒的具體有效成分報道較多，如多糖類、皂苷類、黃酮類、咖啡酰奎寧酸類、生物堿類等[13].有研究表明黃芪、野菊花、金銀花中抗NDV的有效活性成分分別是多糖、黃酮類、有機酸類(綠原酸)[14-15]，本研究也證實黃芪、野菊花和金銀花提取液有較強的抗NDV作用.細(xì)辛的揮發(fā)油成分具有抗人乳頭瘤病毒的作用[16]，馬鞭草能夠抑制乙肝病毒[17]，但二者抗NDV及其他禽類病毒未見相關(guān)報道.因此對于細(xì)辛、馬鞭草抗NDV的有效成分及藥理作用有待進一步研究.

通過黃芪、大青葉等13種中藥提取液對NDV感染DF-1細(xì)胞的預(yù)防、治療和直接滅活試驗，結(jié)果表明黃芪、金銀花、野菊花、馬鞭草和細(xì)辛提取液具有抗較好的抗NDV作用，為抗NDV中藥研究和臨床用藥提供實驗依據(jù).

參考文獻

[1]殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997

[2]周志遠(yuǎn).新城疫的現(xiàn)狀與防制對策[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,16(5):206-207

[3]Kong X F,Hu Y L,Yin Y L,et al.Chinese Herbal Ingredients Are Effective Immune Stimulators for ChickensInfected with the Newcastle Disease Virus[J].Poultry Science,2006,85(12):2169-2175

[4]蔡丙嚴(yán).中藥抗新城疫病毒活性成分的篩選研究[D].揚州:揚州大學(xué),2007

[5]程寶鸞.動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M].廣州:華南理工大學(xué)出版社,1999:103-131

[6]Ngampong K,Pornpat S,Boonsong K,et al.Development of patchouli extraction with quality control and isolation of active compounds with antibaterial activity[J].Kasetsart J Nat Sci,2009，43:519-525

[7]張均田.現(xiàn)代藥理實驗方法[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版,1998：1425-1427

[8]豆艷麗,吳潤,劉磊.新城疫病毒感染不同細(xì)胞的病變特性研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,47(2):1-5

[9]陳艷華,黎丹戎,侯華新,等.不同溶劑和受試物顏色對MTT實驗的影響[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,24(1):17-19

[10]任宇皓,胡元亮,宋大魯,等.黃芪多糖、淫羊藿多糖和淫羊藿總黃酮對NDV血凝性的影響[J].畜牧與獸醫(yī),2001,33(4):27

[11]Zheng Q Y.The immunological activities of Phytolaccaacinosa polysaccharides[J].Information Chin Phamacol Sci,1989(6):22-25

[12]胡克杰,孫考祥,王璟璐,等.氯原酸體外抗病毒作用研究[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2001,35(6):430-432

[13]崔斕斕,張慧茹.淺談中草藥的抗病毒作用[J].中國畜牧獸醫(yī),2007,34(9):149-151

[14]楊曉農(nóng),劉群.家禽常用抗病毒中藥及其應(yīng)用的研究進展[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志,2007(2):8-10

[15]方炳虎,余釵.中西藥抗雞新城疫病毒的體外試驗研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥品雜志,2006：(6):8-11

[16]鄧遠(yuǎn)輝,馮怡,孫靜,等.細(xì)辛抗人乳頭痛病毒的作用研究[J].中藥材,2004,27(9):665-666

[17]陳麗花,李志軍,王定勇.馬鞭草抗乙肝有效部位化學(xué)成分研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報,2009,25(3):242-244

(責(zé)任編輯趙曉倩)

Study of thirteen traditional Chinese medicines anti-newcastle disease virusinvitro

DOU Yan-li1,2,WU Run1,LIU Lei1,QIAN Xu2

(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Animal Husbandry

and Fisheries Technology Promotion Center of Yuzhong,Yuzhong 730100,China)

Abstract：To study the inhibiting effects of traditional Chinese medicines (TCM) against the Newcastle Disease Virus (NDV) in DF-1 cell lines,the study using tissue cell culture method and MTT assay to investigate thirteen TCM on the cytotoxicity,antiviral effects by different subtype of prophylaxis,therapy and direct action.The result showed that water extract from Mongolian Milkvetch Root,Wild Dendranthema Flower,European Verbena Herb,Manchurian Wild ginger Herb killed virus.The water extract of Mongolian Milkvetch Root,Japanese Honeysuckle Flower Bud,Wild Den-dranthema Flower,Manchurian Wild ginger Herb were preventive virus adsorbing cell.The water extract of Mongolian Milkvetch Root,Japanese Honeysuckle Flower Bud,Wild Dendranthema Flower,European Verbena Herb inhibited biosynthesis of virus.The study suggests that the Mongolian Milkvetch Root,Japanese Honeysuckle Flower Bud,Wild Dendranthema Flower,European Verbena Herb,Manch-urian Wild ginger Herb have the effect of anti-NDV in vitro.

Key words：Newcastle disease virus;traditional Chinese medicines;administration pattern;inhibitory action

收稿日期：2014-05-15；修回日期：2014-06-08

基金項目：甘肅省農(nóng)業(yè)科技專項農(nóng)業(yè)科技示范基地建設(shè)項目(06223006).

通信作者：劉磊，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究.E-mail:liul@gsau.edu.cn

中圖分類號：S 831.7;R 285

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)04-0023-05