魯 妮，陳 渝，邱 方，石麗君

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不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道重構(gòu)的影響

魯 妮，陳 渝，邱 方，石麗君

目的：運(yùn)動(dòng)是一種簡(jiǎn)單、有效的高血壓非藥物輔助療法，選擇適宜的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)量是十分重要的。位于VSMC細(xì)胞質(zhì)膜上的L型鈣通道(CaV1.2)對(duì)血管緊張度的調(diào)節(jié)具有關(guān)鍵作用，CaV1.2通道表達(dá)上調(diào)是高血壓的標(biāo)志特征。旨在探討不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道重構(gòu)的影響。方法：54只SHR大鼠隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(SHR-SED，n=18)、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(SHR-M，18～20 m/min，n=18)和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(SHR-H，26～28 m/min，n=18)，運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(1 h/d，5 d/周)。另選用同齡Wistar-Kyoto大鼠(WKY)18只作為安靜正常血壓對(duì)照組。觀察不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)腸系膜動(dòng)脈舒縮特性、CaV1.2通道功能和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：1)大鼠安靜時(shí)收縮壓和心率：SHR-SED組顯著高于WKY組，SHR-M組較SHR-SED組顯著降低，而SHR-H組明顯升高；2)硝苯吡啶(CaV1.2通道阻斷劑)誘發(fā)了大鼠腸系膜動(dòng)脈劑量依賴(lài)性的血管舒張，各組大鼠對(duì)硝苯吡啶的敏感性依次為：SHR-H > SHR-SED > SHR-M > WKY，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使SHR腸系膜動(dòng)脈對(duì)硝苯吡啶的敏感性明顯減弱，相反，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使其明顯增強(qiáng)；3)SHR-SED組腸系膜動(dòng)脈平滑肌CaV1.2通道電流和CaV1.2通道α1c亞基的蛋白表達(dá)均高于WKY組，與SHR-SED組相比， SHR-M組CaV1.2通道電流和CaV1.2通道α1c亞基的蛋白表達(dá)降低，而SHR-H組顯著增加。結(jié)論：高血壓可引起腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞CaV1.2通道功能和蛋白表達(dá)上調(diào)；中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)能有效逆轉(zhuǎn)高血壓動(dòng)脈CaV1.2通道的重構(gòu)，對(duì)改善血管功能具有積極作用，而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)通過(guò)加重CaV1.2通道的不良重構(gòu)進(jìn)一步損害血管功能。

運(yùn)動(dòng)；高血壓；鈣離子通道；腸系膜動(dòng)脈；運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度

高血壓屬于多種病因造成的進(jìn)行性心血管綜合征，研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)阻力血管的結(jié)構(gòu)改變是其高血壓形成的重要因素[1]。有規(guī)律的中低強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)能使高血壓患者血壓一定程度上降低[27]。適宜運(yùn)動(dòng)作為一種非藥物輔助治療高血壓的方法，已為越來(lái)越多的高血壓患者所接受[12]。與高血壓的藥物治療相比，運(yùn)動(dòng)更為簡(jiǎn)單、有效，且具有藥物治療所不具備的優(yōu)勢(shì)[2]。在選擇運(yùn)動(dòng)作為治療手段時(shí)，應(yīng)當(dāng)選擇適宜的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)量，否則會(huì)適得其反。如果能夠證明運(yùn)動(dòng)對(duì)于治療和預(yù)防高血壓的重要作用，明確其機(jī)制，那么，將為高血壓的運(yùn)動(dòng)療法提供切實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也將為相關(guān)運(yùn)動(dòng)方案的制定奠定基礎(chǔ)。

高血壓是一種以血管緊張度升高為特征的臨床綜合征[5]。高血壓發(fā)生時(shí)，內(nèi)皮依賴(lài)的血管舒張功能受損，為應(yīng)對(duì)管腔內(nèi)壓力的持續(xù)升高，血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)出現(xiàn)病理性改變。存在于細(xì)胞膜上的L型電壓門(mén)控鈣離子通道(CaV1.2)在細(xì)胞膜去極化時(shí)開(kāi)放，使Ca2+作為第二信使進(jìn)入細(xì)胞，在腺體激素分泌、神經(jīng)傳導(dǎo)及肌肉的興奮-收縮耦聯(lián)中發(fā)揮重要作用[7]。在高血壓患者及高血壓模型動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)VSMC上CaV1.2通道發(fā)生重構(gòu)[10]。一般認(rèn)為，由于高血壓動(dòng)物的細(xì)胞膜的狀態(tài)更趨于去極化，其VSMC的收縮很大程度上是由電壓依賴(lài)性鈣通道觸發(fā)的。CaV1.2通道是血管平滑肌上主要的Ca2+離子通道，是調(diào)節(jié)微小血管直徑和張力的重要因素[20]。在慢性高血壓時(shí)，由于電壓依賴(lài)性鈣離子通道的開(kāi)放概率增加[28]，導(dǎo)致VSMC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，而增加的胞內(nèi)鈣離子濃度與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)，故CaV1.2通道是抗高血壓治療的重要靶點(diǎn)[4,15]。CaV1.2通道阻斷劑常被用于高血壓的臨床治療中，可有效地作用于靶器官以抑制高血壓的發(fā)展。高血壓疾病中，VSMC細(xì)胞的CaV1.2通道蛋白表達(dá)上調(diào)和CaV1.2通道的電流密度增大與血管的持續(xù)收縮有關(guān)[4]。腸系膜動(dòng)脈是機(jī)體主要的外周阻力血管，在血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不可替代的作用，在高血壓的發(fā)展中也具有重要地位。本實(shí)驗(yàn)采用不同強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓大鼠(SHR)進(jìn)行干預(yù)，探討規(guī)律運(yùn)動(dòng)對(duì)腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞CaV1.2通道的影響。

1 研究方法

1.1 動(dòng)物模型

12周齡雄性正常血壓大鼠Wistar-Kyoto rats(WKY，n=18)和自發(fā)性高血壓大鼠(SHR，n=54)。WKY 組作為正常血壓安靜對(duì)照組，SHR大鼠隨機(jī)分為3組，安靜組(SHR-SED,n=18)、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(SHR-M,n=18)和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(SHR-H,n=18)。運(yùn)動(dòng)組大鼠在坡度為0°的跑臺(tái)上SHR-M組以18～20 m/min (55%～65%max)，SHR-H組以26～28 m/min (70%～85%max)跑速運(yùn)動(dòng)，60 min/d，5 d/周，持續(xù)8周，SHR-M和SHR-H組大鼠運(yùn)動(dòng)量分別為5.4～6.0 km/周和7.8～8.4 km/周。

每周測(cè)定大鼠體重(BW)、安靜收縮壓(SBP)和心率(HR)。SBP和HR采用尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)法測(cè)量(BP-2010A， softron Biotechnology， Beijing)。

1.2 離體微血管張力測(cè)定

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉后斷頭處死；迅速打開(kāi)腹腔，取腸系膜動(dòng)脈放在充氧的4℃ Krebs液中，Krebs液組成為(mM)：NaCl 131.5、KCl 5、NaH2PO41.2、MgCl21.2、CaCl22.5、Glucose 11.2、NaHCO313.5、EDTA 0.025；通以95% O2和5% CO2的混合氣體，pH 7.4。取動(dòng)脈的2級(jí)分支用于制備微血管環(huán)，通過(guò)Multi myograph system(620 M， DMT， Denmark) 測(cè)定張力。

CaV1.2通道抑制劑被用于觀察CaV1.2通道在維持血管緊張度中的作用。實(shí)驗(yàn)中，在刺激血管收縮前，加入一氧化氮合成酶抑制劑L-NAME 100 μM作用20 min以破壞內(nèi)皮功能；用含KCl(120 mM)的L-NAME刺激血管，以血管的凈收縮幅度作為100%最大收縮，觀察其收縮幅度，以確定該血管環(huán)活性良好并進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)；為觀察CaV1.2抑制劑帶來(lái)的舒張效果，先用10-5M的去甲腎上腺素(NE)刺激血管預(yù)收縮，在此基礎(chǔ)上給予10-9～10-5M硝苯吡啶(nifedipine,CaV1.2通道抑制劑)，測(cè)量其張力變化。

1.3 電生理

1.3.1 急性腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離

將已經(jīng)剝離干凈的腸系膜動(dòng)脈置于室溫中平衡5 min，后用剪刀將血管剪成小段，置于酶消化液中，酶消化液組成為2 mg/mL 牛血清白蛋白(BSA)、4 mg/mL 木瓜蛋白酶(papain)、1 mg/mL 二硫蘇糖醇(DTT)、0.6 mg/mL 膠原酶溶于生理鹽溶液，生理鹽溶液組成為(mM)： NaCl 13、KCl 5.6、MgCl21.0、Na2HPO40.42、NaH2PO40.44、NaHCO34.2、NaOH調(diào)整pH至7.3。放入37℃恒溫水浴箱消化30～35 min。待消化完全后，置于室溫生理鹽水中漂洗3次以終止消化，每次2～3 min。然后用拋光吸液管輕輕吹打至無(wú)明顯組織塊，吸取細(xì)胞懸浮液經(jīng)2 mm尼龍布過(guò)濾至細(xì)胞浴槽內(nèi)，置于4℃冰箱貼壁待用。

1.3.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄

CaV1.2電流測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)全細(xì)胞膜片鉗記錄模式[13]。用微電極垂直拉制儀(PC-10， Narashige， Japan)拉制微電極(OD 1.2 mm， ID 0.9 mm， WPI， USA)，充灌電極液后電極阻抗為 2～4 MΩ。電極內(nèi)液成分(mM)：CsCl 130、 HEPES 10、Na2ATP 3、Na2GTP 0.1、MgCl21.5、Glucose 10、EGTA 10、MgATP 0.5、CsOH調(diào)整pH至7.3。細(xì)胞灌流液成分為(mM)：BaCl220、HEPES 10、Glucouse 5、MgCl21、choline chloride 124、CsOH調(diào)整pH至7.4。實(shí)驗(yàn)在25℃下進(jìn)行，用20 mM氯化鋇作為電荷載體，以限制電流衰減。采用的電壓記錄模式：-80 mV鉗制電壓，檢測(cè)電壓為-70～+70 mV，階躍10 mV，持續(xù)350 ms。電流經(jīng)Digidata 1440 (Axon Instruments， USA)模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器，由pClamp 10.2軟件(Axon Instruments， USA)對(duì)全細(xì)胞電流進(jìn)行分析。記錄到全細(xì)胞Ca2+電流后，加入硝苯吡啶0.1 μM以鑒定CaV1.2通道電流，并加入CaV1.2通道特異性激動(dòng)劑BayK 8644 (5 μM)。記錄同一細(xì)胞上加藥前、后的電流，以判斷所加入藥物的作用。

1.4 Western Blotting

提取腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜蛋白，制備SDS-PAGE電泳樣品，每個(gè)泳道等量上樣20 μl(2 μg/μl)。將電泳完成的凝膠上的蛋白以濕轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA封閉后，密封孵育一抗Rabbit polyclonal anti-α1C(1∶200，Alomone Labs， Jerusalem， Israel)，4℃過(guò)夜。次日二抗anti-rabbit IgG-HRP( 1∶6 000， Proteintech Group)室溫孵育1 h后滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑至膜上，放入Bio-Rad Chemi DOC XRS+成像系統(tǒng) (Bio-Rad Laboratories， Hercules， CA， USA)獲取特異性的免疫反應(yīng)發(fā)光條帶。GAPDH為內(nèi)參，以保證每組樣品上樣量一致。蛋白條帶的光密度用Quantity One 軟件(BioRad)測(cè)定。定量時(shí)，用 GAPDH的密度標(biāo)準(zhǔn)化目的蛋白條帶后進(jìn)行各組間比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR體重、血壓的影響

如圖1所示，WKY組和SHR-SED體重(BW)之間無(wú)顯著性差異(WKY：349.1±7.2 g； SHR-SED：349.7±8.5 g)；運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之后，SHR-M(331.4±5.2 g)和SHR-H組(319.2±6.8 g)與SHR-SED組相比均出現(xiàn)了顯著降低(P<0.05)，且SHR-H組體重也顯著低于SHR-M組(P<0.05)。SHR-SED組心臟重量(HW)大于WKY組(WKY：1.15±0.01 g；SHR-SED：1.41±0.05 g；P<0.05)，但SHR各組間的差異無(wú)顯著性(SHR-M：1.39±0.05 g；SHR-H：1.40±0.06 g；P>0.05)。同樣，SHR-SED組心臟重量指數(shù)(HW/BW)大于WKY組(WKY：3.29±0.04；SHR-SED：4.03±0.07；P<0.05)，同時(shí)，SHR-H組的心臟重量指數(shù)(4.38±0.07)明顯大于SHR-M組(4.19±0.10)和SHR-SED組(P<0.05)。

圖1 本研究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心臟重量/體重的影響示意圖Figure 1. Effects of Exercise on BW and HW of Rats

如圖2所示，WKY組大鼠收縮壓(SBP：133.0±6.7 mmHg)和心率(HR：383±16次)均顯著低于SHR-SED組(SBP：196.4±5.5 mmHg；HR:433±13次；P<0.05)。8周有氧運(yùn)動(dòng)后，與SHR-SED組相比，SHR-M組的SBP(165.3±7.2 mmHg)和HR(392±15次)都出現(xiàn)了顯著降低(P<0.05)，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組SHR-H組(SBP：208.4±6.4 mmHg；HR：425±11次)卻明顯高于SHR-M組(P<0.05)。

2.2 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR硝苯吡啶誘導(dǎo)的腸系膜動(dòng)脈舒張反應(yīng)的影響

NE(10-5M)能誘發(fā)血管收縮，NE誘發(fā)的最大收縮力SHR-SED組為132.2%±6.7% Kmax，顯著高于WKY組105.6%±5.8% Kmax(P<0.05)和SHR-M組114.3%±5.2% Kmax(P<0.05)，而SHR-H組為142.4%±6.5% Kmax，與SHR-M組相比顯著增大。如圖3所示，在NE誘發(fā)的收縮出現(xiàn)平臺(tái)期的時(shí)候加入硝苯吡啶(10-9～10-5M)。高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈舒張的硝苯吡啶劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)出現(xiàn)了左移。4個(gè)組的pIC50值(藥物達(dá)到50%的抑制效果時(shí)平均有效濃度的負(fù)對(duì)數(shù))為：WKY:7.14±0.14，SHR-SED:7.56±0.07， SHR-M:7.35±0.09， SHR-H：7.80±0.07 (各組n=6，圖3B)。由此得出，4個(gè)組中腸系膜動(dòng)脈對(duì)硝苯吡啶的敏感性依次為：SHR-H > SHR-SED > SHR-M>WKY(P<0.05)。提示，高血壓大鼠的血管緊張度調(diào)節(jié)可能與上調(diào)的CaV1.2通道有關(guān)。

圖2 本研究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血壓的影響示意圖Figure 2. Effects of Exercise on SBP of Rats

圖3 本研究硝苯吡啶(Nifedipine)誘發(fā)的大鼠腸系膜動(dòng)脈舒張反應(yīng)示意圖Figure 3. Effects of Nifedipine on the Vascular Tension in MAs from Rats

注：圖3A記錄了大鼠腸系膜動(dòng)脈L-NAME(100 μM)作用20 min(虛線(xiàn)箭頭)后， 在NE (10-5M)誘發(fā)血管收縮的基礎(chǔ)上加入CaV1.2通道抑制劑硝苯吡啶(10-9～10-5M)后產(chǎn)生的張力變化。圖3B為硝苯吡啶誘發(fā)腸系膜動(dòng)脈舒張的劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)，各組n=6。

2.3 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道電流的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的CaV1.2通道的電生理特性。圖4A顯示腸系膜動(dòng)脈VSMC細(xì)胞的CaV1.2通道電流。加入BayK 8644(5 μM)后，內(nèi)向電流峰值增大(圖4B)，而硝苯吡啶(0.1 μM)幾乎可以完全抑制內(nèi)向電流(圖4C)。這些特征提示，實(shí)驗(yàn)中記錄到的內(nèi)向電流是CaV1.2通道電流。

以各電壓下的電流密度與測(cè)試電壓描點(diǎn)作圖，即得I-V曲線(xiàn)(圖5)。為消除細(xì)胞大小引起的誤差，I值以電流密度pA/pF表示。SHR-SED組CaV1.2通道的平均電流密度為-18.5±2.1 pA/pF，為WKY組(-9.1±0.3 pA/pF)的2倍左右。8周不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后：中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使SHR大鼠CaV1.2通道電流密度的峰值降為-11.6±1.1 pA/pF，而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使其上升至-27.6±2.7 pA/pF。

圖4 本研究大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌CaV1.2通道全細(xì)胞電流的特性示意圖Figure 4. Whole-cell L-type Ca2+ Channel Currents Recorded in Myocytes of MAs from Rats.

注：圖4為各組大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞全細(xì)胞CaV1.2通道電流。圖A為鉗制電壓從-60～+80 mV(階躍為10 mV)下記錄的CaV1.2通道電流；圖B、C分別為加入5 μM BayK 8644和0.1 μM硝苯吡啶(Nifedipine)后記錄的CaV1.2通道電流(細(xì)胞取自各組6只大鼠，細(xì)胞個(gè)數(shù)：WKY：n=20；SHR-SED：n=22；SHR-M：n=24；SHR-H：n=18)。

2.4 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道α1C亞基表達(dá)的影響

Western Blotting方法比較了4組大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞CaV1.2通道α1C亞基的蛋白表達(dá)(圖6)。對(duì)比于WKY組表達(dá)量(1.00±0.00)，SHR大鼠的α1C亞基出現(xiàn)了過(guò)表達(dá)(3.51±0.25)，SHR-M組為2.51±0.31，SHR-H組為6.51±0.50。

3 討論

自發(fā)性高血壓大鼠SHR與WKY大鼠相比，表現(xiàn)為心率加快，血壓上升和脈壓增大。高血壓時(shí)，血管對(duì)縮血管物質(zhì)NE反應(yīng)性增高，反射性收縮加強(qiáng)；同時(shí)，由于Ca2+通道過(guò)度開(kāi)放，胞內(nèi)鈣離子濃度增大，出現(xiàn)“鈣超載”現(xiàn)象，平滑肌異常收縮使血管阻力增大[6,9]。運(yùn)動(dòng)不僅能調(diào)節(jié)外周植物神經(jīng)的功能，降低交感神經(jīng)的興奮性，緩解疾病中的小靜脈痙攣，還能使毛細(xì)血管擴(kuò)張，減小外周阻力。另外，運(yùn)動(dòng)還能改善患者的不良情緒，使其身心放松，血壓調(diào)節(jié)機(jī)能得到改善。Schultz等人[22]的研究發(fā)現(xiàn)，中低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)有助于降低高血壓患者的安靜血壓，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可能對(duì)高血壓無(wú)明顯影響。本研究顯示，8周中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，SHR-M組大鼠的收縮壓和心率都有所減低，提示，適宜強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能是治療高血壓的一種有效方法；SHR-H組大鼠的血壓和心率均未降低，反而遠(yuǎn)超過(guò)SHR-SED組，提示，大強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)是高血壓疾病的一種重要的危險(xiǎn)因子[11]。高血壓潛在的病理生理學(xué)進(jìn)程可能十分復(fù)雜，并且涉及血管的重構(gòu)、內(nèi)皮功能障礙、平滑肌細(xì)胞增生肥大、細(xì)胞外基質(zhì)的組成和功能改變[19,26]。這些適應(yīng)性改變使血管對(duì)各種生理刺激的收縮反應(yīng)增強(qiáng)，舒張反應(yīng)減弱，最終導(dǎo)致血管緊張度的升高[14]。Azevedo等人[3]證明，中等強(qiáng)度的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)是通過(guò)降低外周血管阻力來(lái)降低SHR大鼠血壓的。運(yùn)動(dòng)使外周血管阻力降低可能的機(jī)制為，運(yùn)動(dòng)中血管切應(yīng)力增大，刺激內(nèi)皮產(chǎn)生一氧化氮，改善了內(nèi)皮功能[23]。

圖5 本研究大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞CaV1.2通道I-V曲線(xiàn)示意圖Figure 5. Current-voltage Relationships of CaV1.2 Currents in VSMCs

注：圖5為各組大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在未加入藥物、加入5 μM BayK 8644和0.1 μM硝苯吡啶(Nifedipine)3種條件下的I-V關(guān)系曲線(xiàn)(細(xì)胞取自各組6只大鼠，細(xì)胞個(gè)數(shù)：WKY：n=20；SHR-SED：n=22；SHR-M：n=24；SHR-H：n=18)。

圖6 本研究大鼠腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道α1C亞基蛋白表達(dá)示意圖Figure 6. Protein Expression of CaV1.2 channel (α1C-) Subunit in Mesenteric Smooth Muscle Cells

注：圖A為WKY、SHR-SED、SHR-M和SHR-H 4組腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道α1C亞基和內(nèi)參GAPDH的Western blot條帶；B為4組腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道α1C亞基的蛋白表達(dá)(相對(duì)GAPDH的含量)統(tǒng)計(jì)圖；*P<0.05，與WKY相比；#P<0.05，與SHR-SED相比；&P<0.05，與SHR-M組相比，各組n=6。

Ca2+通道對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定起重要作用，是維持細(xì)胞內(nèi)鈣濃度穩(wěn)態(tài)的重要結(jié)構(gòu)，其在高血壓發(fā)生發(fā)展中的改變一直是人們的關(guān)注熱點(diǎn)。本研究使用了CaV1.2通道的特異激動(dòng)劑BayK 8644和阻斷劑硝苯吡啶，并記錄了藥物作用下的血管的收縮狀況，發(fā)現(xiàn)SHR大鼠腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道的功能增強(qiáng)，而SHR大鼠進(jìn)行中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，腸系膜動(dòng)脈上 NE誘導(dǎo)的血管收縮和對(duì)硝苯吡啶的敏感性都較SHR-SED大鼠顯著降低。值得注意的是，與SHR-SED組相比，SHR-H組大鼠腸系膜動(dòng)脈NE誘導(dǎo)的血管收縮增強(qiáng)，對(duì)硝苯吡啶的敏感性也更高。提示，過(guò)量運(yùn)動(dòng)會(huì)使SHR腸系膜動(dòng)脈平滑肌CaV1.2通道作用增強(qiáng)。

Tolstykh等[25]和Lozinskaya等[18]學(xué)者經(jīng)過(guò)研究證實(shí)，SHR血管平滑肌細(xì)胞CaV1.2的電流密度增加。本研究發(fā)現(xiàn)，SHR-SED組大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的CaV1.2通道的電流密度約為WKY大鼠的2倍，這也與之前的研究一致[24]；中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，SHR-M組CaV1.2通道電流顯著降低；而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，SHR-H組較SHR-SED組顯著增大。許多文獻(xiàn)資料顯示，在體情況下血壓與VSMC上發(fā)揮功能的CaV1.2通道數(shù)量存在正性相關(guān)[8]。Lawton等[17]也發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，SHR腸系膜動(dòng)脈VSMC上經(jīng)CaV1.2通道內(nèi)流的Ca2+增多，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CaV1.2通道α1C亞基的蛋白表達(dá)也增多。這些結(jié)果與本研究結(jié)果一致：SHR-M組大鼠收縮壓下降的同時(shí)，其腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的CaV1.2通道電流密度也下降。本研究證實(shí)了中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可減弱高血壓的CaV1.2通道重構(gòu)，而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使這種重構(gòu)加劇。然而，高血壓的病程中，是血壓升高導(dǎo)致了鈣通道的重構(gòu)，還是鈣通道重構(gòu)引起血壓升高，其間的關(guān)系還有待開(kāi)展更深入的研究。本研究中，Western Blotting結(jié)果顯示，SHR-SED組CaV1.2通道的α1C亞基表達(dá)水平與WKY組相比出現(xiàn)了顯著升高。提示，高血壓動(dòng)物動(dòng)脈血管CaV1.2通道蛋白表達(dá)的增加可能是其功能上調(diào)的原因。研究發(fā)現(xiàn)，中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)能有效抑制高血壓誘導(dǎo)的CaV1.2通道α1C亞基蛋白表達(dá)的上調(diào)，而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則會(huì)使高血壓疾病中CaV1.2通道的病理性重構(gòu)加劇。

CaV1.2通道由穿孔亞基α1和輔助亞基α2δ和β三者構(gòu)成。Santana等人[21]的研究表明，α2δ1亞基表達(dá)的增加與CaV1.2通道表達(dá)的增加密切相關(guān)；另外也有研究稱(chēng)，β3亞基在高血壓CaV1.2通道表達(dá)上調(diào)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[16]。本研究檢測(cè)了CaV1.2通道成孔蛋白α1C亞基的蛋白表達(dá)水平，證實(shí)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以通過(guò)調(diào)控CaV1.2通道α1C亞基的蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)CaV1.2通道的功能的調(diào)控，但其輔助亞基α2δ和β亞基在高血壓疾病中是否發(fā)生改變，它們與α1C亞基的相互作用和影響以及不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)其表達(dá)是否產(chǎn)生影響，目前還不清楚。另外，本研究中WKY大鼠未進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)，未針對(duì)運(yùn)動(dòng)后的WKY大鼠進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，此為本實(shí)驗(yàn)的不足之處。比較WKY大鼠運(yùn)動(dòng)前、后腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞CaV1.2通道功能和蛋白表達(dá)，有利于全面分析運(yùn)動(dòng)、高血壓及藥物干預(yù)對(duì)CaV1.2通道功能和蛋白表達(dá)的影響，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步補(bǔ)充完善。

4 結(jié)論

高血壓可引起SHR腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞CaV1.2通道功能和蛋白表達(dá)上調(diào)；中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)能降低SHR安靜時(shí)收縮壓，改善其腸系膜動(dòng)脈的CaV1.2通道調(diào)節(jié)的舒縮功能，有效逆轉(zhuǎn)SHR腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道的重構(gòu)，對(duì)改善血管功能具有積極作用，而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)通過(guò)加重CaV1.2通道的不良重構(gòu)進(jìn)一步損害血管功能。

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Effects of Varied-Intensity of Exercise on CaV1.2 Channel Remodeling in Mesenteric Artery from Spontaneously Hypertensive Rats

LU Ni,CHEN Yu,QIU Fang,SHI Li-jun

Objective:Exercise can be considered as a simple and effective non-drug treatment of hypertension.Choosing appropriate intensity and volume is supposed to be of great importance.L-type Ca2+(CaV1.2) channels on the plasma membrane of vascular smooth muscle cells play a key role in modulating vascular tone.CaV1.2 channels upregulation is an ionic feature of hypertension.This study aimed to explore the effects of different intensity of exercise on CaV1.2 channel remodeling of mesenteric artery (MA) from SHR.Methods:Twelve-week-old male SHR rats were randomly divided into SHR sedentary group (SHR-SED,n=18),SHR Moderate-(SHR-M,n=18,18～20 m/min) and high-intensity (SHR-H,n=18,26～28 m/min) of exercise training exercise group.Eighteen age-matched WKY rats were used as normotensive control.Mesenteric arterial mechanical and functional properties were evaluated.Results:Moderate-intensity of exercise training induced lower systolic blood pressure and heart rate than those of SHR-SED.Moderate-intensity of exercise training significantly suppressed tissue sensitivity to nifedipine,CaV1.2 channel currents density,and CaV1.2-α1C subunit protein expression in MAs.However,high-intensity of exercise aggravated all of these hypertension-associated functional and molecular alterations of CaV1.2 channel.Conclusion:Remodeling of MAs contributes to the development and complications of hypertension.The moderate-intensity exercise can effectively reverse the remodeling of CaV1.2 channels in mesenteric artery,which has a positive effect on improving vascular function.High-intensity exercise would exaggerate the adverse remodeling of CaV1.2 channel which impairs vascular function further.

exercise;hypertension;calciumchannel;mesentericartery;exerciseintensity

1000-677X(2015)06-0057-07

10.16469/j.css.201506009

2015-01-07；

2015-05-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31371201)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(2015ZX001)。

魯妮(1990-)，女，云南昭通人，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與心腦血管功能調(diào)控，E-mail：418447726@qq.com；陳渝(1990-)，女，重慶人，在讀碩士研究生，E-mail：313598513@qq.com；邱方(1989-)，女，河北邢臺(tái)人，在讀碩士研究生， E-mail：870325194@qq.com；石麗君(1972-)，女，河北邢臺(tái)人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與心腦血管功能調(diào)控，Tel：(010)62989582，E-mail：l_j_shi72@163.com。

北京體育大學(xué)，北京 100084 Beijing Sport University,Beijing 100084,China.

G804.5

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