張憲亮，徐 波，彭海霞，賀 強(qiáng)，何 標(biāo)，季 瀏

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急性游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞激活、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響

張憲亮1,2，徐 波1,2，彭海霞2，賀 強(qiáng)1，何 標(biāo)2，季 瀏1,2

目的：探討急性游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響。方法：采用8周高脂膳食干預(yù)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠肥胖模型，造模成功后隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(SC)、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(EC)，安靜肥胖組(SO)和運(yùn)動(dòng)肥胖組(EO)，EC和EO分別進(jìn)行急性游泳運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)后8 h后取海馬，用RT-PCR檢測(cè)4組小鼠海馬內(nèi)炎癥因子(TNF-α、 IL-1-β、IL-6、IL-10)mRNA表達(dá)；試劑盒檢測(cè)海馬內(nèi)NO、MDA、SOD水平；流式細(xì)胞儀分析小鼠海馬內(nèi)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果：1)8周高脂膳食誘導(dǎo)小鼠體重極顯著性增加(P<0.01)、糖耐量顯著性下降(P<0.05)。2)與SC組比較，SO組TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)極顯著提高(P<0.01)，EC組IL-10極顯著性降低(P<0.01)；與SO組比較，EO組TNF-α、IL-1β極顯著性降低，IL-6顯著性降低(P<0.05)。3)與SC組比較，SO組NO含量極顯著性提高(P<0.01)，MDA含量顯著性提高(P<0.05)，SOD和Mn-SOD活力顯著性降低；與SO組比較，EO組NO含量顯著性降低(P<0.05)，SOD活力極顯著性提高(P<0.01)，Mn-SOD活力顯著性提高(P<0.05)。4)與SC組比較，SO組海馬內(nèi)CD11b+/CD45hi細(xì)胞與CD11b+/CD45lo細(xì)胞比值極顯著上調(diào)(P<0.01)，與SO組比較，EO組海馬內(nèi)CD11b+/CD45hi細(xì)胞與CD11b+/CD45lo細(xì)胞比值顯著性下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論：急性游泳運(yùn)動(dòng)抑制了高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、減少了炎癥反應(yīng)，降低了氧化應(yīng)激。

急性游泳運(yùn)動(dòng)；小膠質(zhì)細(xì)胞；炎癥反應(yīng)；氧化應(yīng)激；一氧化氮

引言

目前，全世界約有10億人伴有超重或肥胖等癥狀，肥胖已經(jīng)成為一個(gè)公共健康問題[29]。肥胖不但是糖尿病、高血壓、中風(fēng)、心臟病等疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也損害了腦認(rèn)知功能，加劇了阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[3]?；仡櫼酝难芯堪l(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗可能是高脂膳食誘導(dǎo)腦認(rèn)知功能下降的原因之一[12,17,30]。近10年來(lái)，研究證實(shí)，肥胖與長(zhǎng)期的慢性炎癥密切相關(guān)，這種亞急性炎癥反應(yīng)可能通過循環(huán)系統(tǒng)等特異性組織的白介素或細(xì)胞因子的高表達(dá)參與了肥胖介導(dǎo)的并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[13]。

近來(lái)，一些研究人員開始研究高脂膳食對(duì)神經(jīng)炎癥及認(rèn)知功能的影響。Pistell等[28]發(fā)現(xiàn)，高脂膳食損害了腦認(rèn)知功能，并發(fā)現(xiàn)其與腦內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇及BDNF水平降低有關(guān)。Thirumangalakudi等[31]發(fā)現(xiàn)，8周高脂膳食激活了腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞，增加了海馬內(nèi)促炎因子(TNF-α、IL-1-β、 IL-6)表達(dá)，損害了小鼠空間記憶能力。 Freeman等[9]也發(fā)現(xiàn)，高飽和脂肪酸膳食、高不飽和脂肪酸膳食和高膽固醇膳食均可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，改變海馬形態(tài)，其中高飽和脂肪酸膳食影響最大。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種靜息態(tài)的巨噬細(xì)胞，其對(duì)微環(huán)境變化較為敏感，介導(dǎo)了神經(jīng)炎癥反應(yīng)。高脂膳食可以導(dǎo)致胞體較小、分枝較細(xì)的靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞向胞體較大、分枝較多的可分泌促炎因子的活化態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，增加促炎因子或細(xì)胞因子等的表達(dá)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[11]。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞激活可能是高脂膳食誘導(dǎo)海馬內(nèi)長(zhǎng)期慢性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵過程。

高脂膳食可以激活海馬小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，但目前并不清楚是否可以逆轉(zhuǎn)高脂膳食誘導(dǎo)的海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活。研究發(fā)現(xiàn)，適宜的體育運(yùn)動(dòng)可以減輕由衰老[6]、中風(fēng)[2]、高血壓[19]等引起的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，但目前并無(wú)運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)海馬炎癥反應(yīng)影響的研究。僅有Yi等[37]通過對(duì)低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor deficient，ldlr-/-)敲除鼠進(jìn)行高脂膳食，隨后進(jìn)行26周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，并采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)下丘腦Iba陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可以逆轉(zhuǎn)高脂膳食誘導(dǎo)的下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎癥反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)，運(yùn)動(dòng)可以抑制高脂膳食誘導(dǎo)的海馬炎癥反應(yīng)，擬通過8周高脂膳食建立肥胖模型，隨后進(jìn)行急性游泳訓(xùn)練，訓(xùn)練后6～12 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況，并通過RT-PCR檢測(cè)海馬內(nèi)炎癥因子(TNF-α、 IL-1-β、IL-6、IL-10)mRNA表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)海馬內(nèi)NO水平及氧化應(yīng)激水平，探討急性游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖模型海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和分組

5周齡健康雄性C57BL/6小鼠80只，購(gòu)于華東師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(滬)2008-0016。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，分籠飼養(yǎng)，溫度25±2℃，光照時(shí)間12 h左右，自由飲食飲水。隨機(jī)選取40只喂普通飼料，40只喂高脂飼料，8周膳食干預(yù)后，從普通膳食小鼠中選取12只體重正常小鼠(對(duì)照組，C)，從高脂膳食小鼠中選取12只體重增量較大小鼠(肥胖組，O，約占總數(shù)的1/3)，禁食12 h后進(jìn)行糖耐量實(shí)驗(yàn)。隨后將C組分為安靜對(duì)照組(SC，n=6)和運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(EC，n=6)；將O組分為安靜肥胖組(SO，n=6)和運(yùn)動(dòng)肥胖組(EO，n=6)[14]。實(shí)驗(yàn)所用普通飼料和高脂飼料均由上海市斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，其中，普通飼料含水9.2%、粗蛋白21.1%、粗脂肪5.28%、粗灰粉5.2%、粗纖維4.12%及其他無(wú)機(jī)鹽及必須氨基酸等；高脂飼料含54.6%普通飼料，另添加豬油16.9%、蔗糖14%、預(yù)混料2.1%、酪蛋白10.2%及麥芽糊精2.2%。

1.2 糖耐量實(shí)驗(yàn)

在運(yùn)動(dòng)前，將C組和O組禁食12 h后，腹腔注射20%葡萄糖(10 ml/10 g體重)，在注射后即刻、30 min、60 min、90 min、120 min，通過尾靜脈取血，用血糖試紙測(cè)定血糖濃度。

1.3 運(yùn)動(dòng)方案

運(yùn)動(dòng)對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)肥胖組小鼠分別進(jìn)行急性游泳訓(xùn)練[16]，具體方案：將兩組小鼠置于直徑約為45 cm的玻璃容器內(nèi)，水溫約為32℃～33℃，首先適應(yīng)性游泳10 min，為期2天，以適應(yīng)水環(huán)境應(yīng)激。第3天開始正式游泳運(yùn)動(dòng)，兩組小鼠以游泳30 min-休息5 min-游泳30 min-休息5 min……進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)，進(jìn)行4個(gè)循環(huán)，共計(jì)游泳2 h。運(yùn)動(dòng)結(jié)束后2 h內(nèi)自由飲食、飲水，隨后禁食禁水，運(yùn)動(dòng)后8 h開始取材。

1.4 取材

腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠，將其固定于手術(shù)臺(tái)上，打開胸腔，暴露心臟，從心臟左心室尖處灌注0.9%的生理鹽水，取全腦，分離左、右側(cè)海馬組織。左側(cè)海馬用于RT-PCR、NO及氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，右側(cè)海馬用于流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.5 RT-PCR

取適量海馬組織，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)其OD260/OD280在1.80～2.00之間。以20 μl體系，以37℃，15 min，98 ℃，5 min進(jìn)行PCR，逆轉(zhuǎn)錄得到穩(wěn)定的cDNA，-20℃長(zhǎng)期保存。根據(jù)RT-PCR試劑盒說明：加入10 μL SYBR green PCR MasterMix，ROX 0.4 μL，2 μL cDNA，上、下游引物各0.04 μL，補(bǔ)充dH2O至20 μL。TNF-α：上游引物：5′-CTG AAC TTC GGG GTG ATC GGT-3′，下游引物：5′-TCC TCC ACT TGG TGG TTT GCT AC-3′；IL-1β：上游引物：5′-TCC AGG ATG AGG ACA TGA GCAC-3′，下游引物：5′-GAA CGT CAC ACA CCA GCA GGT TA-3′；IL-6：上游引物：5′-GCT GAC CTC TGG ACG CTT AG-3′，下游引物：5′-GGG AGA TGC TTT TGT TCC AA-3′；IL-10：上游引物：5′-CCA GGG AGA TCC TTT GAT GA-3′，下游引物：5′-CAT TCC CAG AGG AAT TGC AT-3′； GAPDH上游引物：5′-ATG GTG AAG GTC GGT GTG-3′，下游引物：5′-AAC TTG CCG TGG GTA GAG-3′。按照RT-PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃，60 s；以95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，45 s為一循環(huán)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，72℃末段延伸5 min。溶解曲線，從60℃～95℃，每升高1 ℃收集一次熒光。記錄Ct值，根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.6 NO含量、MDA含量和SOD活力檢測(cè)

將海馬在PBS中漂洗，濾紙拭干后稱重，取適量海馬，放入研磨管中，按重量體積比1∶9加入PBS制成10%的組織勻漿液，4℃，1 600 g離心10 min，取上清，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度(碧云天，P0009)。

取適量腦組織勻漿液，根據(jù)一氧化氮檢測(cè)試劑盒(碧云天，S0021)檢測(cè)NO含量。

取適量腦組織勻漿液，根據(jù)脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒(碧云天，SO131)檢測(cè)MDA含量。

取適量腦組織勻漿液，根據(jù)CuZn/Mn-SOD活性檢測(cè)試劑盒(碧云天，SO103)檢測(cè)總SOD、Mn-SOD活力。

1.7 流式細(xì)胞儀分析小膠質(zhì)細(xì)胞

將右側(cè)海馬組織置于buffer A(1×DPBS+0.5%BSA)中剪碎，轉(zhuǎn)移至50 ml離心管，加入papain(Worthington公司)(PIPES+L-cystein-HCL+EDTA+8U/ml papain+80U/ml DNaseⅠ)消化液，37℃恒溫水浴鍋孵育消化50 min，加入buffer A反復(fù)吹打，使用70 μm濾膜過濾細(xì)胞懸液，1 000 g，4℃，離心15 min，棄上清。加入FACS buffer(1×DPBS +2 mM EDTA+1%胎牛血清)，4℃，1 000 g，離心10 min。使用30%Percoll重懸細(xì)胞，700 g離心10 min，去除髄磷脂，F(xiàn)ACS buffer沖洗，離心，用FACS buffer重懸，即為單細(xì)胞懸液[22]。20 μg/ml Fc-Block抗體4℃孵育細(xì)胞20 min，小鼠CD11b-PE、CD45-APC熒光標(biāo)記流式抗體暗室孵育細(xì)胞20 min。美國(guó)BD FACS CantoII型流式細(xì)胞儀分離CD11b+/CD45+細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 高脂膳食對(duì)小鼠體重及葡萄糖耐量的影響

80只C57BL/6小鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分為兩組，分別進(jìn)行普通膳食和高脂膳食干預(yù)，8周膳食干預(yù)后，隨機(jī)從兩組選出體重正常者(對(duì)照組)和體重增量較大者(肥胖組)，兩組小鼠體重出現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01，圖1 A)。隨后，分別對(duì)兩組小鼠禁食12 h后，通過糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠血糖濃度在注射葡萄糖后即刻(P<0.01)、30 min(P<0.01)、60 min(P<0.05)、90 min(P<0.05)、120 min(P<0.05)均顯著低于肥胖組小鼠血糖濃度，提示，肥胖組葡萄糖耐量受損(圖1 B)。

圖1 本研究高脂膳食對(duì)小鼠體重及葡萄糖耐量的影響示意圖

注：A.兩組小鼠體重比較.B 空腹注射葡萄糖后兩組小鼠血糖水平比較.與C組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 急性游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠海馬內(nèi)炎性因子mRNA表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR檢測(cè)小鼠海馬內(nèi)炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與SC組比較，SO組TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)極顯著提高(P<0.01)，EC組IL-10極顯著性降低(P<0.01)；與SO組比較，EO組TNF-α、IL-1β極顯著性降低，IL-6顯著性降低(P<0.05,圖 2)。

2.3 急性游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠海馬內(nèi)NO及氧化應(yīng)激的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂膳食增加了海馬NO含量，誘導(dǎo)了海馬氧化應(yīng)激，而運(yùn)動(dòng)可以逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。如圖3 A所示，高脂膳食增加了海馬區(qū)NO含量(P<0.01)，而運(yùn)動(dòng)可以抑制高脂膳食誘導(dǎo)的海馬NO水平上調(diào)(P<0.05)。圖3 B顯示，高脂膳食可以顯著增加海馬內(nèi)MDA水平(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)也會(huì)減少肥胖小鼠海馬內(nèi)MDA含量的增加，但是并沒有顯著性差異(P>0.05)。圖3 C證實(shí)，高脂膳食降低了海馬內(nèi)總SOD和Mn-SOD的活力(P<0.05)，急性游泳運(yùn)動(dòng)可以增加肥胖小鼠海馬內(nèi)總SOD和Mn-SOD的活力(P<0.01)。

圖2 本研究運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠海馬內(nèi)炎癥因子mRNA表達(dá)的影響柱狀圖

注：本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR檢測(cè)了小鼠海馬內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10等炎癥因子的mRNA表達(dá)。與SC組比較，*P<0.05，**P<0.01；與SO組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖3 本研究運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠海馬內(nèi)NO含量和氧化應(yīng)激水平的影響柱狀圖

注：本實(shí)驗(yàn)通過NO、MDA、SOD檢測(cè)試劑盒(碧云天)檢測(cè)了海馬內(nèi)NO含量、MDA含量和SOD活力。A.各組小鼠NO含量比較，B.各組小鼠MDA含量比較，C.各組小鼠SOD、Mn-SOD活力比較.與SC組比較，*P<0.05，**P<0.01；與SO組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.4 急性游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響

本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了海馬內(nèi)的CD11b和CD45陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩簇細(xì)胞群，分別為CD11b+/CD45lo和CD11b+/CD45hi細(xì)胞。CD11b+在腦內(nèi)可以用于標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，而CD45在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)依賴于小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況，如靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞低表達(dá)CD45(CD45lo)，而活化態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)CD45(CD45hi)[38]。因此，CD11b+/CD45lo和CD11b+/CD45hi細(xì)胞分別代表了靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞和活化態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果顯示，與SC組比較，SO組海馬內(nèi)CD11b+/CD45hi細(xì)胞與CD11b+/CD45lo細(xì)胞比值顯著上調(diào)，而與SO組比較，EO組海馬內(nèi)CD11b+/CD45hi細(xì)胞與CD11b+/CD45lo細(xì)胞比值顯著性下調(diào)。提示，高脂膳食可以顯著性激活海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞，而急性游泳運(yùn)動(dòng)可以逆轉(zhuǎn)高脂膳食誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活(圖4)。

圖4 本研究運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖小鼠海馬內(nèi)CD11b+/CD45lo和CD11b+/CD45hi細(xì)胞數(shù)量的影響示意圖

注：PE-A代表CD11b，AmCyan-A代表CD45，P3代表CD11b+/CD45hi，P4代表CD11b+/CD45lo。A：SC組，B：EC組，C：SO組，D：EO組，E：各組CD11b+/CD45hi細(xì)胞與CD11b+/CD45lo細(xì)胞比值，與SC組比較，**P<0.01；與SO組比較，#P<0.05。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，長(zhǎng)期高脂膳食激活了海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)了海馬炎癥反應(yīng)，而急性游泳運(yùn)動(dòng)可以逆轉(zhuǎn)高脂膳食誘導(dǎo)的海馬炎癥反應(yīng)。先前有研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可以逆轉(zhuǎn)長(zhǎng)期高脂膳食誘導(dǎo)的腦認(rèn)知功能下降[23]，并發(fā)現(xiàn)其與海馬內(nèi)BDNF表達(dá)及其信號(hào)通路密切相關(guān)[20,35]。近來(lái)有研究證實(shí)，高脂膳食可以激活海馬小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[7]，但是，目前并無(wú)運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，急性游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠海馬內(nèi)炎癥反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)可能與小膠質(zhì)細(xì)胞激活有關(guān)。

3.1 高脂膳食誘導(dǎo)小鼠肥胖模型

肥胖不僅可以誘導(dǎo)高血壓、心臟病等慢性疾病，也可以誘導(dǎo)腦炎癥反應(yīng)，降低腦功能，然而，誘發(fā)機(jī)體肥胖的因素錯(cuò)綜復(fù)雜，包括遺傳、飲食、生活方式等，其中，高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖模型與人類自然肥胖最為接近，是一種常見的肥胖模型。由于動(dòng)物對(duì)高脂膳食反應(yīng)并不一致，高脂膳食造肥胖模型存在“肥胖型”和“肥胖抵抗型”。因此，本研究將小鼠隨機(jī)分別喂養(yǎng)普通膳食和高脂膳食8周后，分別從兩組中選取體重正常和體重增量較多者作為研究對(duì)象(C和O)。通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠體重具有極顯著性差異。同時(shí)通過糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，O組小鼠血糖在注射葡萄糖后2 h內(nèi)血糖濃度均顯著高于對(duì)照組。提示，8周高脂膳食增加了小鼠體重，損害其糖耐量，8周高脂膳食造肥胖模型成功[14]。

3.2 急性游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠海馬內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響

肥胖不僅可以引起外周組織慢性炎癥反應(yīng)，也可以誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(尤其是海馬)神經(jīng)炎性反應(yīng)[8]。Thirumangalakudi等[3]發(fā)現(xiàn)，8周高脂/高膽固醇膳食增加了C57BL/6小鼠和LDLR敲除鼠海馬內(nèi)炎癥因子TNF-α,IL-1-β,IL-6和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase 2，NOS2)表達(dá)，誘導(dǎo)了海馬神經(jīng)炎性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，8周的高脂膳食增加了海馬內(nèi)TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)，提示8周高脂膳食誘導(dǎo)了海馬內(nèi)神經(jīng)炎性反應(yīng)，與上述研究一致。但也有研究發(fā)現(xiàn)，高脂膳食并沒有引起海馬內(nèi)的神經(jīng)炎性反應(yīng)[18]。研究結(jié)果出現(xiàn)矛盾原因可能為實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物不同、高脂膳食開始干預(yù)時(shí)間不同或膳食中脂肪、膽固醇等的比例不同所致。如Boitard等[4]發(fā)現(xiàn)，青少年期(3周齡)進(jìn)行高脂膳食可以誘導(dǎo)大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)炎性反應(yīng)，而成年期(12周齡)進(jìn)行高脂膳食并不能誘導(dǎo)其神經(jīng)炎性反應(yīng)。Pistell等[28]證實(shí)，60%脂肪含量的高脂膳食增加了腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，而40%脂肪含量的高脂膳食并沒有導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。而本實(shí)驗(yàn)采用5周齡C57BL/6小鼠，發(fā)現(xiàn)添加豬油和蔗糖的高糖高脂飼料可以誘導(dǎo)小鼠海馬內(nèi)炎癥反應(yīng)。

另外，本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，急性游泳運(yùn)動(dòng)可以抑制肥胖小鼠海馬內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)的增加，提示，急性游泳運(yùn)動(dòng)可以抑制高脂膳食誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)炎癥反應(yīng)。目前研究已經(jīng)證實(shí)，運(yùn)動(dòng)可以抑制高脂膳食誘導(dǎo)肥胖模型認(rèn)知功能的下降，其機(jī)制主要涉及到NGF、BDNF等營(yíng)養(yǎng)因子、Akt、MAPK、CREB等信號(hào)通路及突觸可塑性等[20,21,23,35]，但并無(wú)運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)海馬炎癥反應(yīng)影響的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR檢測(cè)了小鼠海馬內(nèi)的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)急性運(yùn)動(dòng)降低了高脂膳食誘導(dǎo)海馬內(nèi)的TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)，提示，運(yùn)動(dòng)可以抑制高脂膳食誘導(dǎo)的海馬炎癥反應(yīng)，推測(cè)其也可能是運(yùn)動(dòng)提高肥胖小鼠認(rèn)知能力的原因，但是，本研究并沒有檢測(cè)其空間記憶能力。

此外，Pervaiz等[27]研究發(fā)現(xiàn)，急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可降低野生型小鼠海馬內(nèi)TNF-α、IL-6等蛋白表達(dá)水平，減少炎癥反應(yīng)。而本實(shí)驗(yàn)中急性游泳運(yùn)動(dòng)并沒有改變對(duì)照組小鼠海馬內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)，其原因可能與運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度不同，或?qū)嶒?yàn)選取動(dòng)物年齡不同，或者所用檢測(cè)方法不同有關(guān)。令人意外的是，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，急性游泳訓(xùn)練顯著性降低了對(duì)照組小鼠海馬內(nèi)IL-10的mRNA表達(dá)，IL-10是一種抗炎因子，可通過抑制Kupffer細(xì)胞(庫(kù)普弗細(xì)胞)的激活和其他炎癥介質(zhì)、自由基、NF-κB等起到抗炎效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，急性游泳運(yùn)動(dòng)抑制了肥胖小鼠海馬內(nèi)炎癥反應(yīng)，卻降低了正常小鼠的抗炎能力。推測(cè)其原因可能為IL-1β、IL-6、IL-10等炎癥因子之間可以相互作用[25]，IL-10的降低可能是由其他炎癥因子的相互作用造成的。

3.3 急性游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠海馬內(nèi)氧化應(yīng)激及NO水平的影響

另外，長(zhǎng)期高脂膳食也可導(dǎo)致腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平提高[10]。本研究中，8周高脂膳食減少了海馬超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及Mn-SOD活力，增加了海馬MDA含量。機(jī)體抗氧化能力由酶促和非酶促兩類抗氧化體系組成，抗氧化酶系包括SOD、CAT等，其中，SOD活力最強(qiáng)，作用最為廣泛。在生物體內(nèi)，由于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的增強(qiáng)及機(jī)體抗氧化能力的減弱，導(dǎo)致機(jī)體大量自由基生成，反應(yīng)終產(chǎn)物MDA含量增多，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等交聯(lián)聚合，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。Alzoubi等[1]發(fā)現(xiàn)，高脂膳食可以抑制海馬內(nèi)SOD活力，損害腦抗氧化能力。White等[34]發(fā)現(xiàn)，8周高脂膳食后SD大鼠腦內(nèi)MDA含量顯著性增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇。本實(shí)驗(yàn)不但檢測(cè)了總SOD活力，也檢測(cè)了Mn-SOD活力，同時(shí)檢測(cè)了MDA含量，結(jié)合先前研究得出，長(zhǎng)期高脂膳食可加劇海馬內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食肥胖小鼠海馬內(nèi)總SOD、Mn-SOD和MDA水平的影響，發(fā)現(xiàn)急性游泳運(yùn)動(dòng)抑制了高脂膳食誘導(dǎo)的海馬內(nèi)SOD、Mn-SOD活力下降。在一項(xiàng)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)上調(diào)了AD小鼠海馬內(nèi)SOD1和SOD2活力，抑制其氧化應(yīng)激水平[33]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示，運(yùn)動(dòng)可通過提高海馬抗氧化能力，減輕高脂膳食誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平。

此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂膳食增加了海馬內(nèi)NO水平，而急性游泳運(yùn)動(dòng)可以抑制高脂膳食誘導(dǎo)的海馬內(nèi)NO水平增多。NO可以與O2—反應(yīng)產(chǎn)生過氧亞硝酸鹽等活性氮，損傷DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等，引起腦功能紊亂[36]。有研究發(fā)現(xiàn)，急性運(yùn)動(dòng)可通過IR/IRS1/Akt信號(hào)通路降低高脂膳食誘導(dǎo)的肌肉內(nèi)iNOS表達(dá)增加[26]。但目前并無(wú)運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠海馬內(nèi)NO含量的研究，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性游泳運(yùn)動(dòng)可通過減少NO含量來(lái)抵制高脂膳食對(duì)腦結(jié)構(gòu)和功能的損害。

3.4 急性游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響

高脂膳食可誘導(dǎo)海馬炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，但其具體機(jī)制不甚清楚。近來(lái)一些證據(jù)顯示，高脂膳食激活了海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞，促使其產(chǎn)生大量炎癥因子、NO等，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Hwang等[15]通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂膳食增加了C57BL/6小鼠腦內(nèi)的Iba-1+細(xì)胞，上調(diào)了促炎因子表達(dá)，提示，高脂膳食可以激活腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。Buckman等[7]采用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對(duì)象，通過流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，高脂膳食小鼠腦內(nèi)GFP+細(xì)胞增多，而80%的GFP+細(xì)胞同時(shí)標(biāo)記有CD11b、CD45蛋白。提示，高脂膳食促進(jìn)外周免疫細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀分析CD11b+/CD45+細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，CD11b+/CD45lo和CD11b+/CD45hi兩簇細(xì)胞團(tuán)，由于CD45在小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)情況依賴于小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀況[38]。因此，CD11b+/CD45hi與CD11b+/CD45lo比值可以代表小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂膳食顯著性上調(diào)了CD11b+/CD45hi與CD11b+/CD45lo比值。提示，高脂膳食增加了活化態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，促使其分泌更多的炎性因子及NO，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，急性游泳運(yùn)動(dòng)可以顯著性抑制高脂膳食誘導(dǎo)的CD11b+/CD45hi/CD11b+/CD45lo比值上調(diào)，減少海馬內(nèi)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，但并沒有進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究。有研究發(fā)現(xiàn)，高脂膳食可擾亂血腦屏障，外周相關(guān)因子通過血液循環(huán)穿過受損的血腦屏障，激活小膠質(zhì)細(xì)胞[32]，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激。而運(yùn)動(dòng)可能通過改善血腦屏障，阻止外周刺激因子進(jìn)入腦內(nèi)激活小膠質(zhì)細(xì)胞。另外， Buckman等[7]發(fā)現(xiàn)，高脂膳食誘導(dǎo)的活化態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增多源自于外周免疫細(xì)胞，因此，推測(cè)運(yùn)動(dòng)也可能通過抑制進(jìn)入腦內(nèi)的外周免疫細(xì)胞數(shù)量減少活化態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，抑制炎癥反應(yīng)。

小膠質(zhì)細(xì)胞是正常生理狀態(tài)下腦內(nèi)的巨噬細(xì)胞，即發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能、也參與腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活及大量促炎因子的釋放可導(dǎo)致腦內(nèi)環(huán)境失調(diào)，誘導(dǎo)認(rèn)知障礙等。研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞存在多種激活表型，其與激活后釋放的促炎和抗炎因子密切相關(guān)[24]。主要分為兩種：M1型為經(jīng)典激活型，主要產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物和促炎細(xì)胞因子，引起炎癥損傷，標(biāo)記物包括IL-6、CCL3等；M2型為選擇激活型，其功能與抑制免疫炎癥反應(yīng)和促進(jìn)組織修復(fù)有關(guān)，標(biāo)記物包括IL-10、CCL1、CCL22等[5]。本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR檢測(cè)了海馬內(nèi)的IL-6和IL-10的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)高脂膳食增加了IL-6表達(dá)，而急性游泳運(yùn)動(dòng)可以抑制IL-6表達(dá)的增加。提示，高脂膳食誘導(dǎo)了M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，而運(yùn)動(dòng)可以抑制高脂膳食誘導(dǎo)的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞增加。但是，本實(shí)驗(yàn)僅用RT-PCR檢測(cè)了海馬內(nèi)的M1型標(biāo)記物(IL-6)和M2型標(biāo)記物(IL-10)的表達(dá)情況，并不能夠完全代表M1型和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞。今后應(yīng)該通過免疫熒光雙染色同時(shí)標(biāo)記IL-6+/Iba+細(xì)胞和IL-10+/Iba+細(xì)胞，或通過流式細(xì)胞儀分選IL-6+/CD11b+細(xì)胞和IL-10+/CD11b+細(xì)胞，或者通過免疫磁珠分離小膠質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的IL-6和IL-10的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)等方法，以確定運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞不同表型的影響。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)，高脂膳食增加了活化態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，上調(diào)了炎癥因子表達(dá)，誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激，而急性游泳運(yùn)動(dòng)可以抑制高脂膳食誘導(dǎo)的海馬小膠質(zhì)細(xì)胞激活，但其具體機(jī)制不甚清楚，有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Acute Swimming Exercise on Microglia Activation,Inflammation and Oxidative Stress in the Hippocampus of High-Fat Diet-induced Obese Mice

ZHANG Xian-liang1,2,XU Bo1,2,PENG Hai-xia2,HE Qiang1,HE Biao2,JI Liu1,2

objective:To determine the effect of acute swimming exercise on hippocampal microglia activation,inflammation and oxidative stress of high-fat diet-induced obese mice.Methods:High-fat diet-induced obese mice were randomly divided into sedentary control group (SC),exercise control group (EC),sedentary obese group (SO),and exercise obese group (EO).EC and EO were underwent acute swimming exercise.After 8 hours,the hippocampus were token.We examined inflammatory factors (TNF-α、 IL-1-β、IL-6、IL-10) mRNA expression using RT-PCR.Using kits to test NO,MDA,SOD levels in the hippocampus.The number of hippocampal activated microglia were analyzed by flow cytometry.Results:1)8 weeks high-fat diet increased the body weight significantly,while glucose tolerance were decreased significantly.2)Comparing with SC,the mRNA expression of TNF-α,IL-6 were upregulated in group SO,while IL-10 mRNA expression were downregulated in group EC.Comparing with group SO,the level of TNF-α,IL-1β,IL-6 were reduced significantly in group EO.3)The contents of NO and MDA were higher while the activity of SOD and Mn-SOD in group SO were lower than those in group SC.And the content of NO lower while the activity of SOD and Mn-SOD in group EO were higher than those in group SO.4)Compared to SC,the rate of CD11b+/CD45hito CD11b+/CD45lowas increased in gourp SO.Whereas it was decreased in group EO compared to group SO.Conclusion:acute swimming exercise inhibited activation of microglia,reduced inflammation and decreased oxidative stress in the hippocampus of high-fat diet-induced obese mice.

acuteswimmingexercise;microglia;inflammation;oxidativestress;nitricoxide

2015-02-10；

2015-08-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31371204)。

張憲亮(1987-)，男，山東德州人， 在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)轶w育學(xué)習(xí)與身心健康， E-mail：zhangheng224@126.com； 徐波(1963-)，男，山東萊陽(yáng)人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)轶w育學(xué)習(xí)與身心健康，E-mail：bxu@tyxx.ecnu.edu.cn；彭海霞(1985-)，女，山東菏澤人，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與骨健康，E-mail：haixiap@163.com。

1.華東師范大學(xué) “青少年健康評(píng)價(jià)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200241；2.華東師范大學(xué) 體育與健康學(xué)院,上海 200241 1.Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention，Ministry of Education，East China Normal University，Shanghai 200241，China；2.East China Normal University，Shanghai 200241，China.

1000-677X(2015)09-0058-07

10.16469/j.css.201508000

G804.5

A