羅 維，張 鵬，艾 磊，周 越，陳曉萍

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不同濃度紅景天苷對成肌細胞體外分化的影響及機制初探

羅 維1，張 鵬2，艾 磊3，周 越4，陳曉萍2

研究目的：探討不同濃度紅景天苷對成肌細胞株C2C12體外分化的影響及可能機制，有望為成肌細胞增殖分化尋求更有效的外源調控物，以促進成肌細胞的移植和臨床應用，同時為進一步開展紅景天苷在體內骨骼肌損傷中的作用及機制研究奠定基礎。研究方法：研究1：紅景天苷對成肌細胞體外分化的影響：1)在C2C12中加入不同濃度紅景天苷處理，在誘導成肌分化過程中，應用相差顯微鏡觀察不同濃度紅景天苷對C2C12分化過程中匯聚、融合和形成多核肌管的影響；2)應用免疫熒光組化方法，分析不同濃度紅景天苷對C2C12成肌分化融合率的影響；3)應用real-time PCR和Western Blotting方法，檢測紅景天苷對C2C12成肌分化特異基因和蛋白表達的影響；研究2：紅景天苷影響成肌細胞體外分化的機制初探：應用Western Blotting方法，檢測紅景天苷處理后C2C12成肌分化中TGF-β/Smad信號通路的變化。結果：50 μg 紅景天苷處理：研究1：1)光鏡觀察結果從形態(tài)學上顯示，紅景天苷處理顯著抑制C2C12細胞的融合和多核肌管的形成；2)免疫熒光檢測結果表明Myosin-neonatal(E-MHC)陽性面積和myogenin陽性核均顯著減少(P<0.05)，顯著抑制C2C12細胞分化過程中肌管形成，促進細胞增殖；3)real-time PCR和Western blotting檢測結果表明，成肌分化特異因子MyoD和myogenin基因和蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)，顯著抑制C2C12細胞分化過程中細胞的融合和肌管的形成；研究2：Western blotting檢測結果表明，紅景天苷顯著抑制C2C12細胞分化效應，伴有Smad2/Smad3磷酸化激活增加，尤其是Smad3激活水平顯著增加(P<0.01)；30 μg紅景天苷處理作用不顯著(P>0.05)。結論：1)紅景天苷能顯著抑制骨骼肌成肌細胞體外成肌分化，并促進骨骼肌成肌細胞激活增殖，促進衛(wèi)星細胞庫儲備增加。2)紅景天苷對骨骼肌成肌細胞體外分化增殖的影響存在劑量依賴性，以50 μg紅景天苷干預能達到顯著效果。3)紅景天苷可能是通過促進TGF-β/Smad通路的關鍵介導子Smad2和Smad3(尤其是Smad3)磷酸化來發(fā)揮作用。

紅景天苷；C2C12細胞； 成肌分化； TGF-β/Smad通路

骨骼肌損傷在運動醫(yī)學領域極為常見，因其愈合質量不穩(wěn)定而成為影響運動員運動壽命的重要因素。骨骼肌成肌細胞，即骨骼肌衛(wèi)星細胞，經分裂融合為多核肌纖維，形成肌小管，最終分化為成熟的骨骼肌細胞[15]，其作為骨骼肌再生中新生肌肉的來源在骨骼肌損傷后的修復中起著非常關鍵的作用[6]。在損傷的骨骼肌中，衛(wèi)星細胞激活并通過增殖分化融合為新的骨骼肌細胞來修復受損的骨骼肌纖維。在臨床上，外源性骨骼肌成肌細胞能較好的融入體骨骼肌細胞中[16]，所以，通過成肌細胞移植來治療運動性損傷具有廣闊的應用價值和前景。然而，因為成肌細胞易于分化、難于擴增的特點，很大程度上影響種子細胞批量獲取，從而阻礙成肌細胞移植的臨床應用[5,18]。因此，研究成肌細胞體外分化的調控對于骨骼肌運動性損傷的治療具有重要的理論與應用意義。目前國內、外公認的成肌細胞體外分化調控因子主要有胰島素樣生長因子-1( IGF-1)[13]和肝細胞生長因子( HGF)[7]等，但他們主要通過促生長來實現(xiàn)對成肌細胞體外分化的抑制，而且他們公認的成瘤作用也限制了其在臨床上的應用[23]。因此，尋求更為有效的成肌細胞體外調控因子，仍然是該領域研究的一個重要課題。C2C12細胞是由C3H小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞永生化而來的細胞株，因為細胞形態(tài)特性均一，可無限代培養(yǎng)，常被用作為骨骼肌衛(wèi)星細胞發(fā)育分化的研究對象。

紅景天苷是紅景天最主要的有效活性成分，其除了有利于抗疲勞、抗衰老、免疫調節(jié)、清除自由基、增強記憶、改善睡眠等外，還能保護心臟、抵抗輻射對人體的傷害、保護造血系統(tǒng)等，對人體亞健康的改善和某些疾病的防治具有重要作用[1,20,21]。目前，有關紅景天/紅景天苷在離體細胞培養(yǎng)中的影響，國內外的研究主要包括紅景天/紅景天苷對脂肪細胞[19]、紅細胞[22]、淋巴細胞[17]、肝細胞和血管平滑肌細胞[3]等影響的研究。而關于紅景天/紅景天苷對骨骼肌細胞的影響，目前國內、外研究極少，僅有個別聚焦于對骨骼肌細胞物質代謝方面影響的研究[12]。迄今為止，未見紅景天/紅景天苷在骨骼肌細胞增殖分化中作用及機制研究的報道。

基于以上研究背景，本研究在紅景天苷對骨骼肌成肌細胞體外增殖分化的影響中展開研究，并提出假設：紅景天苷可能通過調節(jié)TGF-β/Smad信號通路來作用于成肌細胞。本研究不僅在成肌細胞增殖分化外源性干預的基礎研究方面有所創(chuàng)新，而且，有望為調控成肌細胞增殖分化潛能尋找到新的外源性化合物，從而促進成肌細胞的體內移植及臨床應用。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組

成肌細胞株C2C12小鼠骨骼肌成肌細胞，購自中國北京協(xié)和醫(yī)院細胞庫。取一管C2C12細胞復蘇，增殖傳代到足夠細胞量后統(tǒng)一凍存。選取同代細胞作為實驗對象。

紅景天苷，購自中國普思生物科技有限公司，10 mg紅景天苷溶于1 ml無菌PBS配制紅景天苷工作液,即紅景天苷工作液濃度為10 μg/μl。

分組：對照組：1 ml分化液中加入5 μl不含紅景天苷的無菌PBS；30 μg紅景天苷組：1 ml分化液中加入3 μl紅景天苷工作液；50 μg紅景天苷組：1 ml分化液中加入5 μl紅景天苷溶液。

1.2 主要儀器和試劑

細胞孵育箱(Thermo)，倒置熒光顯微鏡(Leica)，電泳槽、電轉儀、電源、玻璃板等(Bio-rad)，TCS SP5激光共聚焦顯微鏡(Leica)，實時定量PCR儀(Eppendorf)；DMEM、胎牛血清(Gibco)，馬血清(Hyclone)，Pax7抗體、Myf5抗體、MyoD抗體、myogenin抗體、Smad2抗體、p-Smad2抗體、Smad3抗體、p-Smad3抗體(abcam)，β-actin抗體、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)，Myosin-neonatal(E-MHC)抗體(SANTA)。

1.3 實驗方法

1.3.1 成肌細胞株C2C12細胞增殖和誘導分化培養(yǎng)

C2C12細胞采用細胞生長液(高糖DMEM、10%FBS、青霉素 100 U/ml以及鏈霉素 100μg/ml)，于5%CO2、37℃細胞孵育箱中孵育。培養(yǎng)過程中，維持細胞密度在70%～90%的狀態(tài)，依細胞生長狀態(tài)1～2天傳代一次。

實驗用細胞以16.5×104個/皿的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿，待細胞生長至70%～80%密度時將細胞生長液更換為細胞分化液(高糖DMEM、2%HS、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml)，誘導分化，每隔24 h更換分化液。每天在顯微鏡下觀察多核肌管形成。

1.3.2 免疫熒光組化方法檢測C2C12細胞誘導分化后肌管融合率

細胞誘導分化120 h后，1 ml 4%多聚甲醛固定細胞30 min，1 ml/皿 1/100 PBST破膜5 h，5%的羊血清封閉1 h；5%的羊血清配制一抗E-MHC和myogenin一抗?jié)舛确謩e為1/100和1/200，過夜；5%的羊血清工作液配制二抗，山羊抗小鼠綠色二抗，二抗?jié)舛染鶠?/200，二抗2 h；配制的DAPI工作液加入細胞培養(yǎng)conforcal皿500 ml/皿，避光儲存于4℃。

激光共聚焦顯微鏡拍攝圖像，導入Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計肌細胞融合率和肌細胞融合面積。

1.3.3 RNA提取與反轉錄及Real-Time PCR方法檢測相關基因表達

細胞誘導分化過程中，每隔24 h收集細胞提取RNA并檢測Pax7、Myf5、Myod和myogenin基因表達，即選取分化0 h、24 h、48 h、72 h和96 h細胞進行基因檢測。

RNA提取與反轉錄1 ml TRIzol/皿使細胞消化裂解，細胞懸液吸入2 ml EP管裂解25 min，4℃離心取上清，加入氯仿200 μl/管，劇烈振蕩搖晃15 s后靜置30 min，4℃離心后取400 ml上端無色部分，加入等體積異丙醇-20℃放置20～30 min，4℃離心留沉淀，分光光度計測濃度，根據(jù)濃度采用試劑盒進行反轉錄，所得cDNA放置-20℃儲存待用。

Real-Time PCR 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫序列利用DNAMAN軟件設計引物：Pax7 上游5′-GGCACAAGATAGTGGAAATGG-3′，下游5′- CGACTGCGACGCTGCTTAC-3′；Myf5 上游5-CCAGCCCCACCTCCAACT-3，下游5-GACCAGACAG-GGCTGTTACATTC-3；MyoD 上游5′-TGGCAGTGAGCACTACAGC-3′，下游5′-CATCTGGCAAAAGCAGCGAAG-3′；myogenin 上游5-GACCCTACAGACGCCCACAA-3，下游5-CCGTGATGCTGTCCACGAT-3；18S 上游5′GCACACATACATGCACGAA3′，下游5′AAAATGAAAGCCCATAGC-C3′； GAPDH 上游5-TTGTGATGGGTGTGAACCACGAGA-3，下游5- CATGAGCCCTTCCACAATGCCAAA -3；以cDNA 2 μl、上游引物和下游引物各1 μl、SYBR Green酶25 μl和注射用水21 μl的反應體系95℃預熱15 min，95℃15 s、62℃15 s、72℃20 s，50個循環(huán)，72℃延伸10 min的反應條件進行PCR，采用2-△△Ct進行數(shù)據(jù)處理。

1.3.4 蛋白提取及Western Blotting 方法檢測相關蛋白表達

蛋白提取 細胞誘導分化96 h后，將細胞刮下吸入2 ml EP管，4℃離心留沉淀，加入配置好的含蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的混合液150 μl/管，混勻，置冰上裂解25 min，期間不斷吹打細胞沉淀；裂解好的蛋白液10 μl加入稀釋過濾好的蛋白定性液，在提前制作的標準曲線上用分光光度計檢測蛋白濃度；剩余140 μl蛋白液中加入等體積2×loading buffer，100℃加熱10 min，4℃離心取上清。提取的蛋白樣本儲存于-20℃待用。

Western Blotting 蛋白上樣量為30 μg，經100 V電壓電泳和60 V電壓電轉后取出NC膜，立春紅預染，5%的脫脂牛奶封閉，Pax7、Myf5、MyoD、myogenin、Smad2、p-smad2、Smad3和p-smad3封閉2 h，beta-Actin封閉過夜；5%的脫脂牛奶封閉液配制一抗，Pax7、Myf5、 Smad2、p-smad2、Smad3和p-smad3一抗?jié)舛葹?/500，MyoD和 myogenin一抗?jié)舛葹?/1 000，均為一抗過夜；beta-Actin一抗?jié)舛葹?/3 000，一抗2 h；5%的脫脂牛奶封閉液配制二抗，Pax7、myogenin和beta-Actin為鼠原一抗，采用山羊抗小鼠二抗，抗體濃度分別是1/500、1/1 000、1/3 000；Myf5、MyoD、Smad2、p-smad2、Smad3和p-smad3為兔原一抗，采用山羊抗兔二抗，抗體濃度均為1/1 000；X射線曝光膠片顯影。

顯影后的膠片掃描導入Image-Pro Plus 6.0進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 實驗結果

2.1 不同劑量紅景天苷干預對C2C12分化中匯聚、融合和形成多核肌管的影響

采用相差顯微鏡觀察誘導分化120 h對照組、30 μg紅景天苷組和50 μg紅景天苷組細胞并隨機選取視野進行拍照(圖1)，觀察對照組和不同劑量紅景天苷組細胞分化狀態(tài)形態(tài)學差異(bar=100 μm)。

由圖1可見，對照組C2C12細胞誘導分化120 h后有明顯粗大的肌管形成，細胞匯聚、融合狀態(tài)好。而與對照組相比，30 μg紅景天苷組細胞也有細長肌管形成，雖然肌管體積較對照組小，但仍可見細胞開始融合，有較多肌管形成，而且細胞增殖狀態(tài)不明顯；而50 μg紅景天苷組細胞成肌分化很大限度的被抑制，僅可見少量細小肌管形成，細胞匯聚融合不明顯，細胞出現(xiàn)明顯增殖。這從形態(tài)學上顯示了紅景天苷能抑制C2C12細胞分化并促進增殖，且存在劑量依賴性，以50 μg紅景天苷干預時成肌抑制效果最明顯。

2.2 不同劑量紅景天苷對細胞融合率的影響

E-MHC( Myosin-neonatal )為新生肌球蛋白，是反應細胞分化狀態(tài)及細胞融合率的標志性指標。

圖2、表1顯示，細胞進行E-MHC免疫熒光染色，隨機選取3個14 mm2視野統(tǒng)計平均數(shù)，對照組E-MHC陽性肌管面積達到9.88 mm2，細胞融合率達到71%。而與對照組相比，30 μg紅景天苷組細胞E-MHC陽性肌管面積為7.98 mm2，細胞融合率依然達到58%；50 μg紅景天苷組細胞E-MHC陽性肌管面積僅2.67 mm2，細胞融合率僅19%。

myogenin為成肌調節(jié)因子家族的主要成員，是評價成肌分化狀態(tài)以及肌管形成的重要指標。

圖1 本研究不同劑量紅景天苷在形態(tài)學上對C2C12成肌分化的影響細胞圖

圖2 本研究紅景天苷對E-MHC表達的影響細胞圖及柱狀圖

表1 本研究 E-MHC陽性面積及融合率一覽表

注：*P<0.05； **P<0.01。下同。

從圖3、表2細胞進行myogenin免疫熒光染色可見，對照組C2C12細胞分化120 h后形成明顯粗大的肌管，myogenin陽性細胞核占視野內總細胞核的48%，30 μg紅景天苷持續(xù)作用后，仍有肌管形成，myogenin陽性細胞核占視野內總細胞核的35%，而50 μg紅景天苷持續(xù)作用后，僅有少量細小肌管形成，myogenin陽性細胞核僅占視野內總細胞核的25%。

同時，由以上相差顯微鏡觀察和免疫熒光染色結果可見，紅景天苷對C2C12骨骼肌細胞增殖分化的影響存在劑量依賴性，與30 μg紅景天苷相比，50 μg紅景天苷干預時作用更明顯。因此，后續(xù)成肌分化特異基因和蛋白檢測選取對照組和50 μg紅景天苷組進行檢測。

2.3 紅景天苷(50 μg)對成肌分化特異基因表達的影響

表3、圖4顯示，隨著分化時間的延長，Pax7基因表達水平逐漸下降，與對照組相比，紅景天苷組Pax7下降幅度更大，且在各分化時程，其表達水平均低于對照組。在分化48 h時，紅景天苷組和對照組差異最顯著，到誘導分化96 h時，紅景天苷組和對照組Pax7基因表達水平無顯著差異；在誘導分化24 h和48 h時，對照組和紅景天苷組Myf5表達無顯著差異，對照組在分化48 h時，Myf5表達出現(xiàn)峰值，而紅景天苷組Myf5的峰值出現(xiàn)在72 h，且遠高于對照組，約為對照組的2.5倍，至分化96 h時，紅景天苷組表達水平依然顯著高于對照組(P<0.01)；隨著分化時長的增加，MyoD和myogenin表達水平都呈現(xiàn)遞增趨勢，其中對照組MyoD表達水平峰值出現(xiàn)在分化96 h(約為0 h表達水平的6倍)，而myogenin表達水平峰值出現(xiàn)在分化72 h(約為0 h表達水平的19倍)，且到分化96 h仍然高水平表達(約為0 h表達水平的15倍)。在誘導分化的任何時段，紅景天苷組細胞MyoD和myogenin表達水平均低于對照組，而2組間MyoD表達水平差異在分化96 h時最顯著，myogenin表達水平差異在分化72 h時最顯著。

圖3 本研究紅景天苷對myogenin表達的影響細胞圖及柱狀圖

表2 本研究myogenin陽性核數(shù)目一覽表

表3 本研究紅景天苷干預對成肌分化不同時程相關基因表達的影響一覽表

0h24h48h72h96hConSalConSalConSalConSalPax71.00±0.040.82±0.060.47±0.02**0.35±0.060.16±0.01**0.22±0.010.23±0.01*0.21±0.030.15±0.02Myf51.00±0.0020.48±0.0010.47±0.0020.95±0.0010.82±0.0010.63±0.072.05±0.31**0.58±0.081.22±0.41**MyoD1.00±0.0311.62±0.280.88±0.422.76±0.561.62±0.12*3.15±0.172.18±0.23*6.15±0.424.13±0.11**Myogenin1.00±0.111.74±0.020.72±0.06*1.62±0.020.26±0.02**19.23±0.247.37±0.02**15.23±0.0214.22±1.04

圖4 本研究紅景天苷對成肌分化相關基因表達的影響柱狀圖

2.4 紅景天苷(50 μg)對成肌分化特異蛋白表達的影響

圖5、表4顯示，C2C12細胞誘導分化96 h后，紅景天苷組細胞Pax7、MyoD和myogenin蛋白表達水平均低于對照組，而Myf5表達水平則顯著高于對照組，紅景天苷組Myf5表達水平約為對照組的2倍。

表4 本研究紅景天苷干預對成肌分化相關蛋白表達的影響一覽表

Pax7Myf5MyoDmyogeninCon1.000±0.0111.000±0.0121.000±0.0121.000±0.031Sal0.812±0.019*1.863±0.014**0.924±0.0180.951±0.035

2.5 紅景天苷處理對C2C12成肌分化中TGF-β/Smad信號通路的影響

圖6、表5顯示，p-Smad3的表達水平隨著紅景天苷劑量的上升而不斷遞增，在30 μg紅景天苷干預下，其表達略有上升，但是，無顯著性差異，到50 μg紅景天苷干預后，其表達激增至對照組的2.1倍，差異非常顯著；而p-Smad2在30 μg紅景天苷作用下，表達量略低于對照組， 50 μg紅景天苷作用后，其表達增至對照組的1.4倍，差異非常顯著，但響應強度不及p-Smad3。Smad2和Smad3表達量則隨劑量增加遞減，這與p-Smad2和p-Smad3的表達水平遞增趨勢是相呼應的。

圖5 本研究紅景天苷對成肌分化相關蛋白表達的影響電泳及柱狀圖

表5 本研究不同劑量紅景天苷對TGF-β/Smad信號通路的影響一覽表

圖6 本研究不同劑量紅景天苷對TGF-β/Smad信號通路的影響電泳及柱狀圖

3 分析討論

3.1 紅景天苷對C2C12細胞體外分化的影響

本研究從形態(tài)學，細胞融合率，成肌分化特異基因和蛋白表達等幾個方面探索不同濃度紅景天苷對C2C12骨骼肌成肌細胞體外分化的影響。本研究以體外培養(yǎng)的成肌細胞株C2C12為研究對象，基本可以排除自體因素的干擾，更能直接說明紅景天苷對骨骼肌成肌細胞的影響。

在形態(tài)學上，50 μg紅景天苷能明顯抑制C2C12細胞融合、匯聚和多核肌管的形成，且在誘導分化過程中仍然能明顯促進骨骼肌細胞增殖。可以推斷，紅景天苷在抑制C2C12骨骼肌成肌細胞分化的同時，也能促進骨骼肌成肌細胞增殖，增加骨骼肌衛(wèi)星細胞庫儲備。而30 μg紅景天苷對成肌細胞的分化有一定的抑制，但效果并不如50 μg紅景天苷明顯，且沒有觀察到細胞增殖的跡象。因此，也可以從形態(tài)學上推斷，紅景天苷對成肌細胞的影響存在劑量依賴性，50 μg紅景天苷效果更顯著。

E-MHC為新生肌球蛋白，是反映細胞分化狀態(tài)及細胞融合率的標志性指標。正常情況下，在細胞增殖期內E-MHC表達極少，而在細胞分化過程中，隨著細胞分化時間的延長，細胞不斷融合匯聚，肌管數(shù)目增多面積增大，則E-MHC陽性表達增加，細胞融合率也上升。myogenin為成肌調節(jié)因子家族的重要成員，調節(jié)著成肌細胞進一步終末分化為肌管肌纖維?？梢园裮yogenin作為評價成肌分化狀態(tài)以及肌管形成的重要指標[2]。本研究中E-MHC和myogenin免疫熒光染色結果可見，50 μg紅景天苷顯著降低細胞融合率，抑制粗大肌管生成，影響成肌分化，而30 μg紅景天苷雖產生一定影響，但與對照組無顯著差異。此時可以確定，與30 μg紅景天苷干預相比，50 μg紅景天苷能更有效的調控骨骼肌成肌細胞體外增殖分化以達到本研究的目的。因此，在接下來的研究中選取50 μg紅景天苷干預濃度來進行成肌分化特異基因和蛋白的檢測，以進一步驗證紅景天苷對骨骼肌成肌細胞體外增殖分化的影響。

Pax7是在成肌細胞中表達的標志性蛋白[11]，Myf5、MyoD和myogenin同屬于MRFs家族，是成肌細胞增殖分化的關鍵調控因子。靜止的骨骼肌衛(wèi)星細胞劇烈運動或受到創(chuàng)傷時，會大量激活Pax7，Pax7和MRFs家族相互作用，促進肌細胞增殖和分化，Myf5是MRFs家族中最早表達的蛋白，衛(wèi)星細胞激活后，大量增殖并伴有Myf5和MyoD的表達，成肌細胞進入分化期后，Pax7和Myf5表達大量下降并開始表達myogenin[4,9,10]。簡而言之，Pax7可以看作是靜止狀態(tài)成肌細胞增殖水平的標志蛋白，Myf5可以看作是激活狀態(tài)成肌細胞增殖水平的標志蛋白，MyoD和Myogenin都可以看作是激活狀態(tài)成肌細胞分化水平的標志蛋白，但MyoD先于myogenin表達。本研究通過每隔24 h實時檢測以上4種基因在誘導分化成肌細胞中的表達驗證了這一結論，即Pax7基因表達峰值出現(xiàn)在誘導分化即刻、Myf5基因表達峰值出現(xiàn)在誘導分化48 h和72 h之間、MyoD和myogenin基因表達峰值出現(xiàn)在誘導分化96 h左右(MyoD表達隨分化時間的延長而逐漸遞增，而myogenin在誘導分化初期表達極少，到分化72 h后出現(xiàn)大幅迅猛增長)。紅景天苷作用后，Pax7基因和蛋白表達水平都顯著低于對照組，Myf5基因和蛋白表達顯著高于對照組，可知紅景天苷不僅能有效促進靜止態(tài)細胞的激活，且還能促進被激活衛(wèi)星細胞的增殖，從而增加衛(wèi)星細胞庫的儲備；在整個細胞誘導分化階段，紅景天苷干預后，MyoD和myogenin的基因表達水平均低于對照組，誘導分化96 h時，蛋白表達水平也低于對照組。

至此可以得出結論，紅景天苷能有效促進骨骼肌成肌細胞的體外激活增殖，抑制骨骼肌成肌細胞的體外分化，從而促進衛(wèi)星細胞庫儲備的增加。本結果一方面為成肌細胞的體內移植及臨床應用奠定實驗基礎，提示，可以考慮將紅景天苷作為骨骼肌成肌細胞體外增殖分化的外源性調控物，來解決成肌細胞自身易分化難擴增的問題，促進種子細胞的批量獲取，進而推動成肌細胞移植的臨床應用，達到通過成肌細胞移植來治療骨骼肌損傷的目的；另一方面，為開拓紅景天苷在體內骨骼肌損傷再生和修復領域的應用提供理論和實驗基礎，提示，紅景天苷或許也可以促進體內骨骼肌衛(wèi)星細胞庫的儲備，增加骨骼肌再生中新生肌肉的來源，從而有效幫助受損骨骼肌的體內再生和修復，不過這需要進一步的體內研究來佐證。

3.2 紅景天苷影響C2C12細胞體外分化機制初探

TGF-β/Smad通路是由轉化生長因子 β(transforming growth factor-β， TGF-β)、TGF-β受體(transforming growth factor-β receptor， TβR)以及受體底物Smad蛋白家族組成，在眾多細胞調節(jié)過程中具有非常關鍵的作用。在成人骨骼肌中TGF-β/Smad通路可抑制衛(wèi)星細胞的分化、肌纖維的融合以及特定基因的表達，Smad2和Smad3是該過程的關鍵調控因子[8,14]。因此，結合以上紅景天苷抑制成肌細胞分化的結論，猜想紅景天苷可能通過作用于TGF-β/Smad通路來影響成肌細胞增殖分化。所以，本研究檢測了不同濃度紅景天苷干預96 h后C2C12細胞中TGF-β/Smad信號通路的關鍵介導子Smad2和Smad3的磷酸化水平。由實驗結果可知，Smad2和Smad3的磷酸化水平(尤其是Smad3)與紅景天苷劑量變化和紅景天苷成肌抑制作用均為正相關，即50 μg紅景天苷作用于誘導分化的骨骼肌成肌細胞時，在抑制成肌分化促進細胞增殖的同時，也可以檢測到Smad2和Smad3磷酸化水平的顯著增加，且同時還檢測到Smad2和Smad3表達水平與其磷酸化水平呈負相關。這說明，紅景天苷可能是通過激活Smad2和Smad3蛋白磷酸化(主要是Smad3蛋白)來發(fā)揮成肌抑制作用，而沒有增加總的Smad2和Smad3蛋白含量。不過該論斷只是初步的探索，更確定的機制研究還有待后續(xù)進一步的研究，同時，30 μg紅景天苷對Smad2和Smad3磷酸化的作用遠不如50 μg紅景天苷，與對照組無顯著差異，這也進一步驗證了本研究中關于紅景天苷最佳作用濃度的結論。

4 結論

1.紅景天苷能顯著抑制骨骼肌成肌細胞體外成肌分化，并促進骨骼肌成肌細胞激活增殖，促進衛(wèi)星細胞庫儲備增加。

2.紅景天苷對骨骼肌成肌細胞體外分化的影響存在劑量依賴性，以50 μg紅景天苷干預能達到顯著效果。

3.紅景天苷可能是通過促進TGF-β/Smad通路的關鍵介導子Smad2和Smad3(尤其是Smad3)磷酸化來發(fā)揮作用。

限于本研究條件有限，一些問題在所難免，需要更多后續(xù)研究來完善和證明：1)紅景天苷對骨骼肌成肌細胞體外增殖分化的效果是否和其濃度存在線性關系，若濃度增加到50 μg以上是否會產生更好的效果；2)關于TGF-β/Smad通路在紅景天苷的成肌調控中的作用還需進一步研究證實。

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Effect of Different Concentrations of Salidroside on Myoblast Differentiation in Vitro and Its Preliminary Mechanism

LUO Wei1,ZHANG Peng2,AI Lei3,ZHOU Yue4,CHEN Xiao-ping2

Objective:This study is aim to explore the effect of different concentrations of salidroside on myoblast differentiation in vitro and its possible mechanism,which can help to find a more effective exogenous regulating substance for myoblast differentiation to promote the myoblast transplantation,and set the foundation for further study of the effect of salidroside on skeletal muscle in vivo.Methods:Part one:The effect of different concentrations of salidroside on myoblast differentiation in vitro:1)observe the morphology of differential myoblast C2C12 which were treated with 0,30,50 μg/ml salidroside to induce differentiation by Phase micrographs;2)Detect the cell fusion index affected by salidroside using immunofluorescence;3)Detect the expressions of myogenic differentiation-specific mRNAs and proteins affected by salidroside using Western Blotting and real time-PCR.Part two:The possible mechanism of above study :Detect TGF-β/Smad3 pathway protein expression in differential C2C12 cell treated with 0,30,50μg/ml Sal using Western Blotting. Results:Treated with 50 μg/ml salidroside:Part one:1)Salidroside inhibit C2C12 fusion and myotube form in morphological by Phase micrographs;2)Myosin-neonatal Positive area and myogenin Positive Nuclei decreased significantly by immunofluorescence(P<0.05),which inhibited myotube form notably;3)The expressions of MyoD and myogenin in mRNA and protein both decreased notably by real-time PCR and Western blotting(P<0.05),which inhibited cell fusion and myotube form during C2C12 differentiation.Part two:Salidroside inhibit C2C12 differentiation associated with increases in Smad2/Smad3 phosphorylation,especially p-Smad3(P<0.01).The results treated with 30 μg/ml salidroside is insignificant (P>0.05). Conclusion:1)Salidroside inhibit myogenic differentiation of C2C12 cell significantly,and promote cell proliferation,to add satellite cells band reserve.2)Salidroside inhibits myogenic differentiation in a dose-dependent manner,50μg/ml Salidroside is the best.3)Salidroside inhibits myogenic differentiation possibly by activating Smad2/Smad3(a key mediator in TGF-β/Smad pathway) phosphorylation.

Salidroside;C2C12cells;myogenicdifferentiation;TGF-β/Smadpathway

2015-03-24；

2015-08-10

國家自然科學基金面上項目(81272177)；南京體育學院科研項目(YJ1423)。

羅維(1989-)，女，湖北荊門人，碩士，主要研究方向為運動生理學，E-mail：luoweihyd@163.com。

1.南京體育學院 運動健康科學系，江蘇 南京 210014；2.中國航天員科研訓練中心，航天醫(yī)學基礎與應用國家重點實驗室，北京 100094；3.江蘇省體育科學研究所，江蘇 南京 210033；4.北京體育大學，北京 100084 1.Nanjing Sport Institute,Nanjing,210014,China;2.State Key Laboratory of Space Medicine Fundamentals and Application,China Astronaut Research and Training Center,Beijing 100094,China;3.Jiangsu Research Institute of Sports Science,Nanjing 210033,China;4.Beijing Sport University,Beijing 100084,China.

1000-677X(2015)09-0050-08

10.16469/j.css.201508000

G804.5

A