沈亞芬，丁勤霞，宋利斌，朱曙東，沈金根

1.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310000；2.桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院，浙江 桐鄉(xiāng) 324500

夏枯草對3種腫瘤細胞抑制作用的實驗研究

沈亞芬1，丁勤霞1，宋利斌1，朱曙東1，沈金根2

1.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310000；2.桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院，浙江 桐鄉(xiāng) 324500

目的：探索夏枯草粗提物對3種腫瘤細胞（淋巴瘤細胞株Jurkat、人肺癌細胞株A-549、子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa）生長抑制作用，為夏枯草抗癌機制的深入研究提供實驗參考依據(jù)。方法：以不同濃度的夏枯草粗提物供試液作用于3種腫瘤細胞，采用MTT法計算其IC50值，觀察藥物對3種腫瘤細胞的抑制作用，同時設(shè)置空白組、對照組、陽性對照組。結(jié)果：夏枯草粗提物對Jurkat細胞、A-549細胞、IShikawa細胞IC50值分別為59.628 mg/mL、53.917 mg/mL、48.017 mg/mL，且夏枯草對3種腫瘤細胞的抑制率在一定范圍內(nèi)隨藥物濃度增加而加強。結(jié)論：夏枯草對Jurkat細胞、A-549細胞、IShikawa細胞的增殖具有一定的抑制作用，對抗癌機制的研究以及臨床抗癌藥物的篩選具有一定的參考價值。

夏枯草；腫瘤；細胞株；MTT法；體外增殖

夏枯草為唇形科多年生草本植物夏枯草(Prunella vulgaris L)的干燥成熟果穗[1]，性寒，味微苦、甘、辛，主入肝經(jīng)、膽經(jīng)，具有清火明目、散結(jié)消腫、清熱活血、祛痰止咳的功效[2～4]。現(xiàn)代藥理研究表明，夏枯草具有降血糖、抗菌消炎、抗病毒感染、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、降血脂、保肝利膽等作用[5]。此外，該藥材對多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[6]。筆者采用MTT法研究夏枯草粗提物對3種腫瘤細胞(淋巴瘤細胞株Jurkat、肺癌細胞株A-549、子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa)體外增殖的影響，為其抗癌機制的深入研究以及臨床用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株 淋巴瘤細胞株Jurkat、肺癌細胞株A-549購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫，子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa由浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科腫瘤實驗室饋贈。

1.2 藥品與試劑 夏枯草購自蕭山醫(yī)藥公司。MEM培養(yǎng)液(HyClone公司，批號：NWL 0507)；優(yōu)級胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，批號：TBD21HY)；胰蛋白酶(0.25%Trypsin-EDTA，Gibco，批號：1023133)；DMSO(二甲基亞砜，Sigma，批號：D8370)；MTT(四甲基偶氮唑鹽，Solarbio，批號：M8180)；其余試劑為分析純；阿霉素(Solarbio，批號：P1421，規(guī)格：10 mL/支)。

1.3 儀器與設(shè)備 酶標儀(BIORAD，日本)；無菌凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；顯微鏡(Olympus IX41)；二氧化碳培養(yǎng)箱(NV-2500E，美國)；微量振蕩器(江蘇金壇市中大儀器廠)；電子天平(BP-2110，德國)。

1.4 癌細胞株的常規(guī)培養(yǎng) 將Jurkat細胞、A-549細胞、Ishikawa細胞置于37℃，5%CO2，濕度95%細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞生長1天后更換培養(yǎng)液，待細胞生長到80%～90%時，棄去培養(yǎng)液，以PBS磷酸鹽緩沖液清洗1～2次，加1 mL 0.25%胰蛋白酶，37℃下消化1 min，棄去胰蛋白酶，加入5～6 mL培養(yǎng)液吹打，分裝至2個不同的培養(yǎng)瓶中，補加培養(yǎng)液，標記，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 夏枯草供試液的制備 對藥材以水煎法提取2 h，加入乙醇，至乙醇濃度為75%，制得夏枯草粗提物，取夏枯草粗提物適量，精密稱定，溶于DMSO中，用細胞培養(yǎng)液分別稀釋配制成含生藥濃度為 24.2 mg/mL，48.4 mg/mL，60.5 mg/mL，84.7 mg/mL，121.0 mg/mL的供試液。供試液中DMSO濃度控制在1%以下。

1.6 MTT比色法測定藥物的抗癌活性 取對數(shù)生長期的淋巴瘤Jurkat細胞、肺癌A-549細胞、子宮內(nèi)膜癌IShikawa細胞(5×104mL-1)接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種細胞懸浮液200 μL，置于37℃、濕度為95%、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞完全貼壁后，吸出培養(yǎng)液。實驗組：加入上述不同濃度的夏枯草供試液；陽性對照組：加入濃度分別為0.04 μg/mL，0.16 μg/mL，0.63 μg/mL，2.50 μg/mL，9.86 μg/mL的阿霉素試液；空白組：只加入細胞培養(yǎng)液；對照組：加入細胞培養(yǎng)液和癌細胞；每個濃度均為4孔，每孔加入體積為200 μL，培養(yǎng)48 h后，每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h后，小心吸掉孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入150 μLDMSO，低速振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，在酶標儀上測定各孔OD值，測定波長570 nm，計算細胞的生長抑制率。以上實驗平行做兩次，計算平均值。細胞生長抑制率(%)=(對照孔測定的平均OD值-加藥組測定的平均OD值)/ (對照孔測定的平均OD值-空白孔測定的平均OD值)× 100%。

1.7 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均以SPSS17.0進行分析，計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，行χ2檢驗；計量資料以(±s)表示，行t檢驗。

2 結(jié)果

各組對腫瘤細胞增殖的抑制作用比較，見表1、表2、表3。不同濃度的供試液對3種腫瘤細胞的增殖均有一定的抑制作用，IC50值分別為59.628 mg/mL、53.917 mg/mL、48.017 mg/mL，并且在一定范圍內(nèi)，夏枯草對細胞的抑制率隨藥物的濃度增加而加強，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

表1 各組對Jurkat細胞增殖抑制作用比較

表2 各組對A-549細胞增殖抑制作用比較

3 討論

癌癥嚴重威脅著人類的生命安全，有效的抗癌藥物的篩選對癌癥的治療具有重要的意義。MTT法利用外源性MTT與活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶反應生成水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚，并在細胞中進行沉積，而死細胞卻不呈現(xiàn)這種現(xiàn)象，以此反映活細胞存在的數(shù)量。在一定的細胞數(shù)范圍內(nèi)，產(chǎn)生MTT結(jié)晶的量與活細胞數(shù)目成正比[7]。此種方法準確性高，重現(xiàn)性好，靈敏度高，且經(jīng)濟適用等優(yōu)點。目前已廣泛應用于抗腫瘤藥物活性的篩選、一些生物活性因子的活性檢測、細胞毒性試驗等[8]。實驗研究表明，夏枯草對肺癌細胞、胃癌細胞SGC-7901、淋巴癌細胞Raji、食管癌Eca-109細胞等具有一定的抑制作用[9]。其中李軍等[10]報道夏枯草可以有效的激活P53蛋白、抑制Bcl-2蛋白的表達，促使淋巴癌細胞Raji的凋亡。本文采用MTT法研究了夏枯草粗提物對Jurkat細胞、A-549細胞增殖的影響、同時首次研究了夏枯草粗提物對IShikawa細胞增殖生長的影響，結(jié)果顯示與對照組比較，夏枯草對Jurkat、A-549、Ishikawa 3種腫瘤細胞均有一定的抑制作用，其IC50值分別為59.628 mg/mL、53.917 mg/mL、48.017 mg/mL，且一定濃度范圍內(nèi)，藥物對3種腫瘤細胞的抑制率呈現(xiàn)劑量依賴性。通過對夏枯草體外抗腫瘤細胞活性進行初步篩選，為該藥材抗癌機制深入研究及臨床用藥奠定了基礎(chǔ)。

表3 各組對IShikawa細胞增殖抑制作用比較

[1]梁杰康，張琳，嚴曉明．HPLC-ECI-MS/MS鑒定夏枯草的主要化學成分[J]．中國中醫(yī)藥，2013，11(14)：153-154．

[2]張明智，鄭曉珂，劉宏民，等．夏枯草提取物體外誘導EL-4細胞凋亡的實驗研究[J]．江蘇中醫(yī)藥，2008，40 (4)：80-83．

[3]鄭學芝，鄭學海，李佳，等．夏枯草提取物對人食管癌Eca-109細胞增殖和凋亡的影響[J]．中國食物與營養(yǎng)，2012，18(9)：74-73．

[4]張明智，張可杰，王慶端，等．夏枯草對淋巴瘤細胞增殖的影響[J]．醫(yī)藥論壇雜志，2007，28(1)：54-55．

[5]許松日，金光，李文，等．夏枯草醇提取物對正常大鼠離體胸主動脈環(huán)的舒張作用[J]．四川中醫(yī)，2010，28 (4)：52-53．

[6]張麗丹，蘇潔，呂圭源，等．夏枯草的藥理研究與臨床應用[J]．海峽藥學，2011，23(5)：143-145．

[7]張淼，董寶婧，苗芳，等．夏枯草提取物的抗氧化活性[J].草業(yè)科學，2012，29(9)：1477-1481．

[8]賈曉斌，封亮，陳彥，等．夏枯草肺癌化學預防物質(zhì)基礎(chǔ)研究思路與方法[J]．中草藥，2009，40(2)：316-318.

[9]李艷麗．夏枯草水提物對自發(fā)性高血壓大鼠降壓作用的研究[J]．中外醫(yī)學研究，2012，10(30)：147．

[10]李軍，楊慧玲．夏枯草誘導人淋巴瘤Raji細胞凋亡及其機制[J]．中國老年學雜志，2011，31(13)：2528-2529.

（責任編輯：駱歡歡）

·書訊·《血液科專病中醫(yī)臨床診治》由人民衛(wèi)生出版社出版。本書立足中醫(yī)臨床，側(cè)重治療，突出實用，對血液專科部分疾病的中醫(yī)臨床診斷治療的經(jīng)驗及其研究成果進行認真總結(jié)，以現(xiàn)代醫(yī)學病名為綱，收載臨床常見、具有中醫(yī)藥優(yōu)勢、療效較好的血液及造血系統(tǒng)疾病，如缺血性貧血、溶血性貧血、巨幼細胞性貧血、再生障礙性貧血、急性白血病、慢性白血病等共計13種，每個疾病分概述、病因病機、臨床表現(xiàn)、實驗室和其他輔助檢查、診斷要點、鑒別診斷、治療、難點與對策、經(jīng)驗與體會、現(xiàn)代研究、評述等項內(nèi)容介紹。本書特點之一為立足中醫(yī)臨床，側(cè)重對治療方法和經(jīng)驗的全面深入總結(jié)，即在明確西醫(yī)診斷基礎(chǔ)上介紹確實有效的中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合及西醫(yī)的綜合治療方法和經(jīng)驗，既突出中醫(yī)藥特色與優(yōu)勢，又不回避中西醫(yī)結(jié)合及西醫(yī)的長處，比較客觀地反映了當前血液?？频闹嗅t(yī)臨床實際，且內(nèi)容豐富，臨證治療思路清晰，實用價值高。特色之二是本書的可讀性強，為集中體現(xiàn)作者的臨證經(jīng)驗和處理棘手問題的水平及獨到見解，特在難點與對策、經(jīng)驗與體會中總結(jié)了作者多年臨床的經(jīng)驗；為開闊讀者臨證思路，特匯集了中醫(yī)血液?？魄拜?、專家們臨床實踐的精華，在醫(yī)案精選、名醫(yī)專家論壇欄目詳細介紹給讀者，以期能提高廣大臨床工作者的診療水平。因此，本書為一部深入總結(jié)該?？婆R床醫(yī)療和研究成果的高級參考讀物，可供中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合臨床、教學、科研工作者學習參考，也可作為血液科培訓?？茖２〖夹g(shù)人才的輔導讀物。每冊定價58元。需要者請匯款到廣州市番禺區(qū)廣州大學城外環(huán)東路232號廣州中醫(yī)藥大學《新中醫(yī)》編輯部發(fā)行科收，郵政編碼510006，電話020-39354129。

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2014-11-30

沈亞芬（1974-），女，主管中藥師，研究方向：中藥材重金屬含量測定。