張男，趙茗，申勇，孫亞澎

（河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院脊柱外科，石家莊 050051）

miR?24對大鼠脊髓損傷后運動功能的影響

張男，趙茗，申勇，孫亞澎

（河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院脊柱外科，石家莊 050051）

目的觀察miR-24對大鼠脊髓損傷后運動功能恢復(fù)的影響。方法健康成年Sprague-Dawley大鼠60只，隨機分為miR-24組、對照組和假手術(shù)組（Sham組），每組20只。Sham組只暴露脊髓，不打擊。對照組和miR-24組采用Allen’s方法損傷大鼠T9脊髓節(jié)段，制備脊髓損傷動物模型。造模成功后30 min，miR-24組鞘內(nèi)注射agomir-24（0.5 nmol/L，5 μL），對照組鞘內(nèi)注射等量的agomir對照，每日1次，共3次。采用BBB評分法分析大鼠后肢運動功能，實時PCR檢測脊髓組織中miR-24表達水平，HE染色觀察大鼠脊髓組織病理形態(tài)學(xué)變化，實時PCR和Western blot檢測脊髓組織中Bim mRNA和蛋白的表達水平。結(jié)果與Sham組相比，對照組大鼠損傷后1、3、7和14 d脊髓組織中miR-24表達均降低，其中3、7及14 d差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組相比，miR-24組大鼠損傷后3、7和14 d BBB評分均顯著升高（P＜0.05）；損傷后1和3 d脊髓損傷形態(tài)學(xué)均有改善，損傷后3 d改善更明顯；損傷后1和3 d脊髓組織Bim mRNA和蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論miR-24可能通過抑制Bim的表達，促進脊髓損傷大鼠運動功能的恢復(fù)。

脊髓損傷；miR-24；agomir-24；Bim；細胞凋亡

脊髓損傷是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，導(dǎo)致?lián)p傷部位以下運動和感覺功能障礙［1］。脊髓損傷嚴重的病理后果和高昂的治療費用給患者帶來極大的痛苦，同時也成為巨大的社會醫(yī)療負擔。但是目前尚無能治愈脊髓損傷的醫(yī)療措施，因此脊髓損傷的修復(fù)和康復(fù)治療的研究具有重要的臨床意義。MicroRNA（簡稱miRNA）是一類廣泛存在于真核生物中、長度為22～28個核苷酸、含量豐富的非編碼小RNA，其通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)互補配對，抑制蛋白合成或誘導(dǎo)mRNA降解，從而實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平對目的基因表達進行負性調(diào)控［2］，調(diào)節(jié)細胞的代謝、增殖、分化和凋亡等生理過程。近來研究表明，若干miRNA在脊髓損傷中的表達水平有不同程度的上調(diào)或下調(diào)，提示脊髓損傷的發(fā)生與miRNA之間存在一定的相關(guān)性［3］。但有關(guān)miR-24在脊髓損傷中的作用及可能的作用機制目前尚不清楚。

本研究通過髓鞘內(nèi)注射agomir-24以提高脊髓中miR-24含量，觀察agomir-24注射后大鼠后肢運動功能變化、大鼠脊髓損傷組織病理變化及Bim的表達水平，明確miR-24對脊髓損傷后大鼠運動功能的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級成年健康Sprague-Dawley大鼠60只，雌雄不限，體質(zhì)量（250±20）g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。將大鼠隨機分為miR-24組、對照組和假手術(shù)組（Sham組），每組20只。

1.2 主要試劑和儀器

agomir-24及對照購自廣州市銳博生物科技有限公司；β-actin小鼠單克隆抗體和Bim小鼠單克隆抗體購自美國Abcam公司；羊抗小鼠IgG-HRP購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。全自動酶標儀和電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Dounce勻漿器（美國Wheaton公司）；-80℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）；高速冷凍離心機（美國Eppendorf公司）；MX3000P Real-time PCR擴增儀（美國Agilent公司）。

1.3 模型制備與agomir-24干預(yù)

參照Allen’s方法制作大鼠脊髓損傷模型。擊打棍由不銹鋼材料制成，直徑4.0 mm，質(zhì)量20 g，擊打棍套管內(nèi)直徑4.1 mm，打擊高度為2.5 cm，以出現(xiàn)脊髓充血、雙下肢痙攣抖動、尾巴痙攣性擺動視為造模成功。術(shù)后立即腹腔注射0.9%氯化鈉注射液9 mL/kg以補液。術(shù)后3 d內(nèi)，每天腹腔注射8×104U青霉素鈉以防感染。術(shù)后大鼠可自由飲水、進食，飼養(yǎng)環(huán)境中須保持適宜的溫度和濕度，定時清潔籠具，并保持大鼠身體干燥，每天擠壓膀胱排尿3次，至大鼠恢復(fù)自主排尿。造模成功后30 min，miR-24組鞘內(nèi)注射5 μL agomir-24（0.5 nmol/L），每日注射1次，共3次。對照組造模成功后鞘內(nèi)注射等量的agomir對照。

1.4 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分

損傷后1、3、7和14 d分別從對照組和miR-24組隨機抽取5只大鼠進行BBB評分，以分析后肢運動功能。評分標準：第1步（0～7分）評判動物后肢各關(guān)節(jié)活動；第2步（8～13分）評判動物后肢的步態(tài)和協(xié)調(diào)功能；第3步（14～21分）評估動物運動時爪子的精細運動。3項滿分21分。采用雙盲法，每次評分由經(jīng)培訓(xùn)后的2人分別獨立完成，左右兩側(cè)分別評分后取平均值作為最后評分。

1.5 HE染色

損傷后1和3 d分別從對照組和miR-24組隨機抽取5只大鼠，取嚴重段脊髓組織制備組織石蠟切片，每只大鼠隨機選取2張切片進行HE染色，光鏡下觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 實時PCR

取新鮮脊髓組織，根據(jù)Trizol操作說明，提取細胞總RNA。提取的總RNA定量后，對于蛋白編碼基因使用Oligo（dT）作為逆轉(zhuǎn)錄引物，對于miRNA使用miRNA特異的逆轉(zhuǎn)錄引物，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。使用適量的cDNA作為PCR模板，MX3000P Real-time PCR擴增儀進行PCR反應(yīng)，SYBR染料實時檢測擴增產(chǎn)物的量，以GAPDH為內(nèi)參分析蛋白編碼基因表達情況，以U6為內(nèi)參分析miRNA的表達情況。所使用引物序列如下：Bim引物序列：5′-GCCCCTACCTCCCTACAGAC-3′（F），5′-ATGGTGGTGGCCATACAAAT-3′（R）；miR-24引物序列：GCTCTGGCTCAGTTCAGCAGG（F），CAGTGC AGGGTCCGAGGT（R）；U6引物序列：CTCGCTTCGG CAGCACATATACT（F），ACGCTTCACGAATTTGCG TGTC（R）；GAPDH引物序列：TCAACGACCACTTTG TCAAGCTCA（F），GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT（R）。

1.7 Western blot

收集新鮮脊髓組織并提取蛋白，上樣蛋白30 μg，電泳（10%SDS-PAGE凝膠），轉(zhuǎn)?。?0 V，120 min），5%正常小牛血清封閉、抗Bim（1∶1 000，美國Abcam公司）和抗β-actin（1∶1 000，美國Abcam公司），4℃孵育過夜，分別與各自對應(yīng)的二抗（北京中杉公司）室溫孵育2 h，加ECL顯色劑（北京中杉公司）1 min，X線膠片曝光成像。結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀（Chemi Image 5500，美國Alpha Innotech公司）采集，進行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量指標采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓損傷組織中miR-24的表達

利用實時PCR檢測脊髓損傷后1、3、7和14 d大鼠脊髓組織中miR-24的表達（圖1）?？梢奡ham組各時間點大鼠脊髓組織miR-24表達無顯著改變；與Sham組相比，對照組大鼠各時間脊髓組織miR-24表達均降低，損傷后3、7和14 d時2組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 大鼠脊髓損傷組織中miR?24的表達Fig.1 The expression of miR?24 in spinal cord tissue of rat after injury

2.2 agomir-24鞘內(nèi)注射對大鼠脊髓損傷組織中miR-24表達的影響

采用實時PCR檢測鞘內(nèi)注射agomir-24對損傷脊髓組織中miR-24表達的影響。與對照組相比，miR-24組大鼠脊髓組織中miR-24表達顯著升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 agomir?24對大鼠脊髓損傷組織中miR?24表達的影響Fig.2 Effects of agomir?24 on the expression of miR?24 in spinal cord tissue of rat after injury

2.3 agomir-24鞘內(nèi)注射對大鼠運動功能的影響

采用BBB評分方法評估agomir-24注射對大鼠運動功能的影響。與對照組相比，miR-24組大鼠BBB評分均增高，其中損傷后3、7、14 d評分顯著增加（P＜0.05）。見圖3。

2.4 agomir-24鞘內(nèi)注射對大鼠脊髓組織形態(tài)學(xué)的影響

對照組大鼠脊髓出現(xiàn)典型的損傷改變，表現(xiàn)為炎性細胞增多，神經(jīng)元水腫、變形，空泡形成。miR-24組大鼠脊髓損傷明顯減輕。見圖4。

2.5 agomir-24鞘內(nèi)注射對脊髓組織中Bim表達的影響

實時PCR檢測Bim mRNA表達水平，Western blot檢測Bim蛋白表達水平。與對照組相比，脊髓損傷后1和3 d，miR-24組大鼠脊髓損傷組織中Bim mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

作為miRNA的一員，miRNA-24同樣擁有典型的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，便于miRNA-24與靶基因mRNA的結(jié)合。目前研究表明，miRNA-24在心肌缺血、腫瘤發(fā)生等病理生理過程中發(fā)揮著重要功能。有研究報道m(xù)iRNA-24與細胞凋亡相關(guān)，具有抑制細胞凋亡的作用［3，4］。另有研究表明miRNA-24參與細胞分化的過程，可能通過抑制Trib3表達促進胚胎干細胞向造血細胞分化［，5］。此外，miRNA-24通過調(diào)節(jié)細胞增殖參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，但表現(xiàn)不一，其中miRNA-24通過MAPK信號通路增強粒細胞的增殖，進而參與急性髓系白血病發(fā)生發(fā)展［6］，相反miRNA-24則可抑制骨肉瘤U-2OS細胞的增殖［7］。近來有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷組織中miR-24低表達，提示miR-24可能參與脊髓損傷的發(fā)生發(fā)展過程中，但其確切作用及可能機制尚不清楚［8］。

圖4 各組大鼠損傷后3 d脊髓組織形態(tài)學(xué)變化 HE×20Fig.4 Morphological changes of spinal cord tissue 3 days after the injury HE×20

圖5 各組大鼠脊髓損傷組織中Bim的表達Fig.5 Bim expression in spinal cord tissue of rats in each group after the injury

本研究首先檢測了脊髓損傷大鼠脊髓組織中miR-24的表達，以明確miR-24是否參與大鼠脊髓損傷過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脊髓損傷組織中miR-24表達顯著降低，這與以往報道一致［9］。為進一步明確miR-24是否參與脊髓損傷的修復(fù)，我們進一步通過鞘內(nèi)注射agomir-24以增加脊髓中miR-24，評價miR-24增加對脊髓損傷的修復(fù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射agomir-24后，miR-24表達顯著增加，脊髓損傷大鼠后肢功能恢復(fù)，脊髓損傷病理形態(tài)學(xué)明顯改善，這提示miR-24可促進大鼠脊髓損傷的修復(fù)。

細胞凋亡作為脊髓損傷的重要機制之一，長久以來一直是這方面研究的熱點，其中凋亡蛋白家族Bcl-2家族一直都是重點研究對象。Bim屬于Bcl-2家族蛋白的促凋亡蛋白，其在多種組織中表達，并參與各種病變或損傷引起的病理過程。Bim的功能主要是誘導(dǎo)細胞凋亡，在神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中的大部分細胞凋亡過程都是由Bim所介導(dǎo)的。Qian等［9］研究發(fā)現(xiàn)miR-24可通過靶向沉默Bim抑制小鼠心肌細胞的凋亡，提示Bim可作為miR-24的靶基因。那么miR-24是否可以通過靶向沉默Bim促進脊髓損傷修復(fù)，目前尚無清楚。

為了進一步明確miR-24參與脊髓損傷修復(fù)的分子機制，本研究通過分析髓鞘注射agomir-24后miR-24的靶基因之一Bim表達變化，以分析miR-24可否通過靶向沉默Bim促進脊髓損傷修復(fù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，agomir-24鞘內(nèi)注射后，Bim mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，提示miR-24通過抑制Bim表達，促進大鼠脊髓損傷的修復(fù)。

本研究結(jié)果證明，miR-24對脊髓損傷后大鼠運動功能恢復(fù)有促進作用，其可能機制與其靶向沉默Bim有關(guān)，這為miR-24在脊髓損傷治療的臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。但miR-24的作用是否受到細胞內(nèi)其他信號分子的調(diào)控，其對脊髓損傷的治療效果是否受到劑量的影響等，還有待深入研究。

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（編輯 陳 姜）

Effect of miR-24 on the Motor Function after Spinal Cord Injury in Rats

ZHANGNan，ZHAOMing，SHENYong，SUNYa-peng

（Department of Spine Surgery，The Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050051，China）

Objective To observe the effect of miR-24 on the motor function after spinal cord injury（SCI）in rats，and explore the related mechanism.MethodsA total of 60 healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group，sham group and miR-24 group with 20 rats in each group.SCI model was made by Allen′s mode at the level of the 9th thoracic vertebra.30 min after SCI model was made，rats in miR-24 group were given agomir-24（0.5 nmol/L，5μL）daily for3 times by intrathecally injection，while rats in control group were given an equal volume of agomir control.The motor function was evaluated by BBB score.The miR-24expression in spinal cord tissue was detected by real-time PCR.The pathological change of spinal cord tissue was observed by HE staining.The Bim mRNA and protein expression in spinal cord tissue were detected by real-time PCR and Western blot，respectively.ResultsCompared with that in sham group，miR-24expression in spinal cord tissue of rats from control group was decreased at 1 d，3 d，7 d and 14 d after injury，and the difference was significant at 3 d，7 d and 14 d（P＜0.05）.Compared with that in control group，BBB score in rats from miR-24 group was significantly increased at 3 d，7 d and 14 d after injury（P＜0.05）.The morphology of spinal cord injury in rats from miR-24 group was improved at 1 d，3 d after injury，and the effect was more significantly at 3 d after injury.The mRNA and protein expression of Bim in spinal cord tissue of rats from miR-24 group were all decreased significantly after injury（P＜0.05）.Con?clusionmiR-24 promote the recovery of motor function of rats with spinal cord injury by inhibiting the expression of Bim.

spinal cord injury；miR-24；agomir-24；Bim；apoptosis

R651.2

A

0258-4646（2015）11-1012-05

張男（1983-），男，主治醫(yī)師，碩士.

申勇，E-mail：shenyongsy@gmail.com

2015-05-26

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