鄒金海，王艷生

(河北省滄州市中心醫(yī)院,河北 滄州 061001)

腹水CD64及外周血mCD14檢測在肝硬化合并自發(fā)性細菌性腹膜炎中的價值研究

鄒金海，王艷生

(河北省滄州市中心醫(yī)院,河北 滄州 061001)

目的探討肝硬化合并自發(fā)性細菌性腹膜炎(SBP)患者腹水CD64及外周血mCD14的變化及其意義。方法選取肝硬化合并腹水患者87例，根據(jù)是否合并SBP將患者分為2組：合并SBP 44例為研究組，未合并SBP 43例為對照組，采用流式細胞術(shù)檢測2組患者腹水中性粒細胞和淋巴細胞CD64平均熒光強度、CD64指數(shù)，外周血白細胞計數(shù)、mCD14陽性表達率、mCD14平均熒光強度和mCD14指數(shù)。研究組抗感染治療1周后再按治療有效與無效、生存與死亡分組評價腹水中性粒細胞和淋巴細胞CD64平均熒光強度、CD64指數(shù)，外周血mCD14平均熒光強度和mCD14指數(shù)。結(jié)果研究組腹水中性粒細胞CD64平均熒光強度、CD64指數(shù)和外周血白細胞計數(shù)明顯高于對照組(P均<0.05)，淋巴細胞CD64平均熒光強度、mCD14陽性表達率、mCD14平均熒光強度和mCD14指數(shù)均明顯低于對照組(P均<0.05)。治療有效組和生存組中性粒細胞CD64平均熒光強度和CD64指數(shù)均明顯低于治療無效組和死亡組(P均<0.05)，淋巴細胞CD64平均熒光強度、mCD14平均熒光強度和mCD14指數(shù)均明顯高于治療無效組和死亡組(P均<0.05)。腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測對治療效果和預后判斷的ROC曲線下面積、臨界值、靈敏度和特異度均明顯高于CD64、mCD14單項檢測(P均<0.05)。結(jié)論肝硬化合并SBP患者腹水中性粒細胞CD64顯著增高，腹水淋巴細胞CD64與外周血mCD14顯著降低，腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測預示肝硬化合并SBP治療效果和預后的價值顯著。

腹水；CD64；mCD14；肝硬化；自發(fā)性細菌性腹膜炎

肝硬化患者機體免疫力低下，門靜脈高壓形成，胃腸道充血、水腫，導致細菌容易通過損傷腸道黏膜屏障進入循環(huán)系統(tǒng)，造成自發(fā)性細菌性腹膜炎(Spontaneous bacterial peritonitis,SBP)，但早期SBP癥狀和體征缺乏特異性，早期診治存在困難[1]。中性粒細胞CD64分子在細菌感染性疾病中顯著增高，但在類風濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、病毒感染性疾病等疾病中變化不明顯[2]。mCD14是細菌細胞壁碎片識別受體之一，對細菌微生物免疫反應具有重要的作用。相關(guān)研究顯示，mCD14在重癥感染性疾病中顯著減少，且與疾病病情程度顯著相關(guān)[3]。目前關(guān)于腹水CD64、外周血mCD14在肝硬化并SBP中的變化及其臨床意義報道少見，故筆者進行了相關(guān)研究，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 選取2013年4月—2014年4月在我院治療肝硬化合并腹水患者87例，均符合《肝臟疾病預防與治療指南》中關(guān)于肝硬化、腹水的診斷標準，血清清蛋白梯度(Serum albumin gradient，SAG)和腹水清蛋白梯度(Ascites albumin gradient，AAG)均≥11g/L。排除有腹腔外感染癥狀者，繼發(fā)性腹腔感染、其他系統(tǒng)感染和有抗感染藥物應用史者。根據(jù)臨床癥狀、實驗室檢查結(jié)果明確是否合并SBP，SBP診斷標準：有腹痛腹瀉、嘔吐、腹部壓痛和腸梗阻等局部腹膜炎癥狀，發(fā)熱畏寒，外周血白細胞計數(shù)顯著增高，呼吸急促，肝功能惡化，胃腸道出血，急性腎功能損傷，休克，肝性腦病，腹水中性粒細胞計數(shù)≥250×108L-1，腹水細菌培養(yǎng)陽性， SAG/AAG≥11g/L，其中符合SAG/AAG≥11g/L，其他項符合至少2項者確診。根據(jù)是否合并SBP將患者分為2組：合并SBP 44例為研究組，男34例，女10例；年齡34～68(51.34±7.05)歲；疾病類型：乙肝病毒性肝硬化12例，丙肝病毒性肝硬化7例，酒精性肝硬化5例，乙肝病毒合并酒精性肝硬化8例，丙肝病毒合并酒精性肝硬化4例，肝硬化合并肝細胞癌3例，膽汁性肝硬化3例，隱源性肝硬化2例；肝功能Child-Pugh評分(10.28±2.01)分。未合并SBP 43例為對照組，男35例，女9例，年齡34～69(50.75±7.14)歲；疾病類型：乙肝病毒性肝硬化12例，丙肝病毒性肝硬化6例，酒精性肝硬化6例，乙肝病毒合并酒精性肝硬化7例，丙肝病毒合并酒精性肝硬化5例，肝硬化合并肝細胞癌2例，膽汁性肝硬化3例，隱源性肝硬化2例；肝功能Child-Pugh評分(10.04±1.49)分。2組患者性別、年齡、疾病類型和肝功能Child-Pugh評分比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 檢測所有入選者腹水CD64和外周血mCD14水平。對于確診為SBP患者均給予抗感染藥物治療1周，1周后再按治療有效與無效、生存與死亡分組檢測上述指標。療效評估標準[4]：局部腹膜炎癥狀和全身炎癥性癥狀逐漸緩解，腹水中性粒細胞計數(shù)<250×108L-1，腹水細菌培養(yǎng)陰性者評估為有效；局部腹膜炎癥狀和全身炎癥性癥狀無改善甚至惡化，腹水中性粒細胞計數(shù)≥250×108L-1，腹水細菌培養(yǎng)陽性者評估為無效。

1.3檢測方法 ①試劑與儀器：CANTO-Ⅱ流式細胞儀、Eppendorf 5810R高速冰凍離心機、CD64抗體試劑盒、紅細胞裂解液、異硫氰酸熒光素標記性MCD14單克隆抗體、溶血素、同型免疫球蛋白由美國BD公司提供，System XT-2000i血常規(guī)儀，HITACHI7600型全自動生化分析儀，Stago-Compact 血凝功能分析儀，Cobase411電化學發(fā)光儀。②標本采集方法：入院治療前采集外周血，送檢血液常規(guī)、凝血功能、肝功能和腎功能等，腹腔穿刺術(shù)采集腹水，送檢10～15 mL至常規(guī)細菌培養(yǎng)，5 mL腹水測定清蛋白水平，100 mL腹水用于細胞計數(shù)，100 mL腹水行流式細胞儀測定，5 h內(nèi)完成腹水CD64測定，確診SBP患者治療1周后采集上述檢測標本送檢。③腹水CD64檢測方法：將100 mL腹水250 g離心8 min，棄上清液，調(diào)整細胞數(shù)目至(1～2)×109L-1，取1 mL細胞懸浮液，采用50 μm尼龍篩網(wǎng)過濾至流式細胞專用試管中250 g離心8 min，棄上清液，100 μL細胞懸浮液加入CD64抗體20 μL，混合搖勻后室溫環(huán)境下避光染色1 h，紅細胞裂解液溶血洗滌后采用流式細胞儀測定中性粒細胞和淋巴細胞CD64平均熒光強度，計算CD64指數(shù)(中性粒細胞CD64平均熒光強度與淋巴細胞CD64平均熒光強度比值)。④mCD14檢測方法：采用流式細胞術(shù)檢測外周血單核細胞膜表面mCD14，采集50 μL外周全血與10 μL mCD14抗體孵育，室溫環(huán)境下避光15 min，滴加1 mL溶血素，室溫環(huán)境下避光10 min，1 000 r/min離心操作5 min，棄上清液，滴加PBS緩沖液離心5 min，棄上清液，滴加PBS緩沖液待測，采用同型免疫球蛋白對照，流式細胞儀采集樣本，觀察mCD14陽性表達率及mCD14平均熒光強度,計數(shù)mCD14指數(shù)。mCD14指數(shù)=mCD14陽性表達率×mCD14平均熒光強度×外周血白細胞計數(shù)/10 000。

2 結(jié) 果

2.12組腹水中性粒細胞和淋巴細胞CD64平均熒光強度及CD64指數(shù)比較 研究組中性粒細胞CD64平均熒光強度和CD64指數(shù)均明顯高于對照組(P均<0.05)，淋巴細胞CD64平均熒光強度明顯低于對照組(P<0.05)。見表1。

2.22組外周血mCD14陽性表達率、mCD14平均熒光強度、mCD14指數(shù)及白細胞計數(shù)比較 研究組mCD14陽性表達率、mCD14平均熒光強度和mCD14指數(shù)均明顯低于對照組(P均<0.05)，外周血白細胞計數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

2.3治療有效組和治療無效組腹水CD64、外周血mCD14比較 治療有效組中性粒細胞CD64平均熒光強度和CD64指數(shù)均明顯低于治療無效組，淋巴細胞CD64平均熒光強度、mCD14平均熒光強度和mCD14指數(shù)均明顯高于治療無效組(P均<0.05)。見表3。

表1 2組腹水中性粒細胞和淋巴細胞CD64平均熒光強度及CD64指數(shù)比較

組別nmCD14陽性表達率/%mCD14平均熒光強度外周血白細胞計數(shù)/109L-1mCD14指數(shù)研究組442.71±0.0745.62±14.074.41±1.05115.24±24.15對照組434.61±1.02127.36±15.023.71±0.09350.26±50.14t3.255.044.015.12P<0.05<0.05<0.05<0.05

2.4生存組和死亡組腹水CD64、外周血mCD14比較 生存組中性粒細胞CD64平均熒光強度和CD64指數(shù)均明顯低于死亡組(P均<0.05)，淋巴細胞CD64平均熒光強度、mCD14平均熒光強度和mCD14指數(shù)均明顯高于死亡組(P均<0.05)。見表4。

2.5腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測對治療效果和預后的預測價值 根據(jù)ROC曲線(見圖1和圖2)，腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測對治療效果和預后的預測的ROC曲線下面積(AUC)、臨界值、靈敏度和特異度均明顯高于CD64、mCD14單項檢測(P均<0.05)。見表5。

3 討 論

晚期肝硬化免疫力顯著降低，容易形成SBP，其中肝硬化合并脾臟功能異常者容易導致白細胞計數(shù)減少，合并細菌感染性疾病時，外周血白細胞計數(shù)同樣減少[5],白細胞計數(shù)對于肝硬化合并SBP診斷靈敏度和特異度均較低。此外，臨床用于細菌感染性疾病的評估指標有外周血中性粒細胞比例、血清CRP、降鈣素原和紅細胞沉降率等，但這些指標在急性創(chuàng)傷、外科術(shù)后、腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤等情況下均顯著增加[6]。腹水細菌培養(yǎng)是細菌感染的診斷金標準，但所需時間較長。CD64是免疫球蛋白IgG的Fc受體之一，是免疫球蛋白超家族成員，主要分布于中性粒細胞、巨噬細胞和單核細胞表面，呈低表達水平。機體在細菌感染等應激性作用下，中性粒細胞CD64因子迅速升高，因此，CD64可作為細菌感染性疾病的早期診斷和評估標準[7]。單核細胞在重癥感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的意義。相關(guān)研究顯示，重癥胰腺炎外周血mCD14陽性表達率、mCD14平均熒光強度和mCD14指數(shù)表達較陰性對照組顯著降低，其中存活患者上述指標逐漸升高，而死亡患者無顯著升高傾向，說明mCD14低水平表達提示預后欠佳[8]。有研究顯示，重癥感染患者住院24h內(nèi)采集外周全血測定mCD14表達較正常人群高，由于短期內(nèi)免疫亢進現(xiàn)象導致；炎癥發(fā)生24h后炎癥免疫亢進現(xiàn)象消失，mCD14平均熒光強度較健康人群顯著降低[9]。

表3 治療有效組和治療無效組腹水CD64、外周血mCD14比較

表4 生存組和死亡組腹水CD64、外周血mCD14比較

表5 腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測對治療效果和預后的預測價值

注：①與CD64聯(lián)合mCD14檢測比較，P<0.05。

圖1 CD64、mCD14指數(shù)對治療效果的預測價值

圖2 CD64、mCD14指數(shù)對預后的預測價值

本研究結(jié)果顯示，合并SBP患者中性粒細胞CD64平均熒光強度、CD64指數(shù)和外周血白細胞計數(shù)明顯增高，而淋巴細胞CD64平均熒光強度明顯降低，與文獻[10]報道結(jié)果具有一致性。同時，mCD14陽性表達率、mCD14平均熒光強度和mCD14指數(shù)明顯降低，提示肝硬化合并SBP患者處于免疫抑制狀態(tài)。本研究結(jié)果還顯示治療有效患者和生存患者腹水CD64指數(shù)顯著降低，外周血mCD14指數(shù)顯著增高，CD64、mCD14指數(shù)兩者聯(lián)合對治療效果的預測價值明顯優(yōu)于單項檢測，與文獻[11]報道相符 。

綜上所述，肝硬化合并SBP患者腹水中性粒細胞CD64顯著增高，腹水淋巴細胞CD64與外周血mCD14顯著降低，腹水CD64與外周血mCD14聯(lián)合檢測預示肝硬化合并SBP治療效果和預后的價值顯著。

[1] 魏成敏，呂其軍，周芳. 肝硬化患者自發(fā)性細菌性腹膜炎感染控制的研究[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志，2014，24(18)：4534-4536

[2]FariasMG,deLucenaNP,DalBoS,etal.NeutrophilCD64expressionasanimportantdiagnosticmarkerofinfectionandsepsisinhospitalpatients[J].JImmunolMethods,2014, 414(1):65-68

[3]AlvesPT,FujimuraPT,MoraisLD,etal.RevisitingthemCD14:epitopemappingbyphagedisplay[J].Immunobiology,2014,219(11):822-829

[4] 聶為民，涂波，張昕，等. 抗菌藥物治療自發(fā)性細菌性腹膜炎臨床療效評價[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志，2014，24(10)：2433-2435

[5] 馬玉秀，于國英，辛曉恩. 肝硬化患者自發(fā)性腹膜炎腹水感染的病原菌分析[J]. 中華醫(yī)院感染學雜志，2014，24(16)：3915-3917

[6] 許建華，許斌，劉妮. 肝硬化并發(fā)自發(fā)性細菌性腹膜炎的感染菌種及抗菌藥物的分析[J]. 中華消化雜志，2014，34(6)：406-408

[7]AnnunziataP,CioniC,CantalupoL,etal.ImmunosuppressivemonoclonalantibodytoCD64frompatientswithlong-termstablemultiplesclerosis[J].JNeuroimmunol,2013,256(1/2):62-70

[8]MinkovG,YovchevY,HalachevaK,etal.ClinicalsignificanceofdynamicmonitoringofHLADR,HLADRbright,mCD14+/CD4+,mCD14+/CD16-,mCD14+/CD16+andmCD14+/CD56+monocyteexpressioninthepredictionandevaluationofpatientswithacutepancreatitis[J].Pancreatology,2014,14(3):64

[9] ?akrMadenci?,YakupoluS,BenzonanaN,etal.EvaluationofsolubleMCD14subtype(presepsin)inburnsepsis[J].Burns,2014,40(4):664-669

[10] 劉光亮，王娜，陳春波，等. 腹水CD64指數(shù)對失代償期肝硬化并發(fā)自發(fā)性細菌性腹膜炎的診斷價值[J]. 重慶醫(yī)學，2013，42(32)：3863-3866

[11] 李薇，謝聞悅，張衛(wèi)云，等.HLA-DR/mCD14在外周血單核細胞中的表達及其臨床意義[J]. 解放軍醫(yī)學雜志，2011，36(1)：61-63

Study on the value of combined detection of ascites CD64 and peripheral blood mCD14 for hepatocirrhosis patients with spontaneous bacterial peritonitis

ZOU Jinhai, WANG Yansheng

(The Center Hospital of Cangzhou, Cangzhou 061001, Hebei, China)

Objective It is to investigate the change and significance of ascites CD64 and peripheral mCD14 for hepatocirrhosis patients with spontaneous bacterial peritonitis (SBP). Methods 87 hepatocirrhosis patients with ascites were selected and divided into two groups according to whether combined SBP, 44 cases combined SBP in research group, and 43 cases none SBP in control group. Flow cytometry was used to detect the average fluorescent intensity and index of CD64 in ascites neutrophils and lymphocytes, and the peripheral blood white blood cell count, mCD14 positive expression rate, mCD14 average fluorescence intensity and mCD14 index of the two groups. The fluorescent intensity and index of CD64 in ascites neutrophils and lymphoctesand the peripheral blood mCD14 in research group were compared according to effective and invalid, survival and death respectively. Results The neutrophils CD64 average fluorescence intensity and CD64 index of and peripheral blood leukocyte count of the research group were significantly higher than those of the control group (allP<0.05), the lymphocyte CD64 average fluorescence intensity, mCD14 positive expression rate, monocytes mCD14 average fluorescence intensity and mCD14 index were significantly lower than those of the control group (allP<0.05). The neutrophils CD64 average fluorescence intensity and CD64 index of effective treatment/survival group were significantly lower than those of ineffective/death group (allP<0.05), and lymphocyte CD64 average fluorescence intensity, monocytes mCD14 average fluorescence intensity and mCD14 index were significantly higher than those of ineffective/death group (allP<0.05). The area under the ROC curve (AUC), the critical value, sensitivity and speciality rate of ascites CD64 and peripheral blood mCD14 combined detection for therapeutic effect and prognosis prediction were significantly higher than those of CD64 or mCD14 single detection (allP<0.05). Conclusion Ascites neutrophils CD64 level is significantly higher, ascites lymphocytes CD64 and peripheral blood mononuclear cells mCD14 levels is decreased significantly, the combined detection of ascites CD64 and peripheral blood mCD14 has significant value in the predicts therapeutic effect and prognosis for hepatocirrhosis with SBP.

ascites; CD64; mCD14; hepatocirrhosis; spontaneous bacterial peritonitis

鄒金海，男，碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事專業(yè)核醫(yī)學技術(shù)與免疫學技術(shù)在臨床中的應用研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.30.006

R657.31

A

1008-8849(2015)30-3324-04

2015-03-30