雷明，趙美瞇，封瑞，王紅梅，毛楠，朱彤，郝麗英

（1.中國醫(yī)科大學藥學院藥物毒理學教研室，沈陽 110122；2.東北大學環(huán)境生物學教研室，沈陽 110004）

·論著·

Cav1.2通道CT1片斷突變體的質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達

雷明1，趙美瞇1，封瑞1，王紅梅1，毛楠1，朱彤2，郝麗英1

（1.中國醫(yī)科大學藥學院藥物毒理學教研室，沈陽 110122；2.東北大學環(huán)境生物學教研室，沈陽 110004）

目的構(gòu)建心肌Cav1.2通道CT1片段及其突變體與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）重組的融合蛋白原核表達載體，并進行蛋白表達和純化。方法以豚鼠Cav1.2通道CT1質(zhì)粒（pGEX-6p-3/CT1）為模板，采用定點突變技術構(gòu)建CT1 T1603A和CT1 T1603D兩種突變體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，大量培養(yǎng)后用IPTG誘導GST融合蛋白表達，分離純化后采用SDS-PAGE檢測CT1及其突變體蛋白的相對分子量和純度。結(jié)果CT1片段及其突變體融合蛋白得到了正確、大量表達，提取純化后的CT1片段及其突變體融合蛋白具有較高的純度。結(jié)論成功構(gòu)建了Cav1.2通道CT1片斷及其突變體融合蛋白原核表達載體，獲得了CT1突變體融合蛋白，為深入研究CT1片斷在Cav1.2通道調(diào)節(jié)中的作用和機制奠定基礎。

融合蛋白；CT1；突變體

電壓依賴性鈣通道（voltage-dependent Ca2+channel，VDCC）按照電生理特性分為低電壓依賴型及高電壓依賴型2種，按照藥理學及生物物理學特性分為T、L、N、P/Q和R型［1，2］，其中L型鈣通道（L-type Ca2+channel，LTCC）可以被二氫吡啶類藥物硝苯地平所阻斷，也稱為二氫吡啶受體。LTCC是研究最為廣泛的高電壓依賴型鈣通道之一，存在于大多數(shù)可興奮細胞膜上，如骨骼肌、心臟、腦、內(nèi)分泌細胞、神經(jīng)元及其他組織。在心肌細胞中，L型鈣通道介導的鈣離子內(nèi)流觸發(fā)肌漿網(wǎng)鈣釋放通道ryanodine受體開放，肌漿網(wǎng)存儲的鈣離子大量釋放，這種級聯(lián)效應稱為“鈣致鈣釋放”（Ca-induced Ca2+release，CICR），在心臟的興奮收縮耦聯(lián)（excitationcontraction couple，EC）中起著關鍵性作［3］，LTCC的調(diào)節(jié)方式多種多樣，異常復雜［4，5］。

前期研究［6～8］發(fā)現(xiàn)，鈣離子、鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）、鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ（Ca/ calmodulin-dependent protein kinasesⅡ，CaMKⅡ）等都是通過與LTCC C末端的CT1（1 509～1 789）片段特定的氨基酸或氨基酸序列相互作用發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。CaM可直接與心肌細胞Cav1.2鈣通道CT1片段結(jié)合，從而對鈣通道鈣離子依賴性易化作用進行調(diào)節(jié)［9，10］，CaMKⅡ通過磷酸化CT1片段上的1 603位蘇氨酸以調(diào)節(jié)鈣通道的功能［11］。為了更好研究1 603位蘇氨酸在Cav1.2鈣通道調(diào)節(jié)中的作用，本研究以豚鼠Cav1.2通道CT1為模板，采用定點突變技術將1 603位蘇氨酸分別突變?yōu)楸彼幔–T1 T1603A）和天門冬氨酸（CT1 T1603D），模擬其去磷酸化和磷酸化狀態(tài)，制備純化蛋白并進行相應的活性鑒定，為研究Cav1.2鈣通道的磷化調(diào)節(jié)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達質(zhì)粒pGEX-6p-3/CT1和BL21菌株由本實驗室保存。異丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）、溶菌酶（1ysozvme，LYS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DDT）、N-十二烷基肌氨酸鈉（N-laurylsarcosine，N-Lau）、氨芐西林（ampicillin，Amp）均購自美國Sigma公司；PreScission Pmtease和GS-4B beads購自德國GE Healthcare公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自英國OXOID公司；其他試劑均購自美國BIOSHARP公司。CT1定點突變由本研究組提供原始質(zhì)粒作為模板和突變位置信息，由上海生工生物工程股份有限公司代為完成突變和序列測定。

1.2 BL21感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化

應用42℃精確熱激法進行感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化，將CT1及其突變體質(zhì)粒導入BL21感受態(tài)細胞，構(gòu)建相應的原核表達系統(tǒng)。具體方法如下：分別量取pGEX-6p-3/CT1、pGEX-6p-3/CT1 T1603A和pGEX-6p-3/CT1 T1603D質(zhì)粒各5 ng，加入到50 μL E.coli BL21感受態(tài)細胞，輕輕混勻后冰浴30 min，再放入42℃水浴鍋熱擊45 s，快速轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2 min。加入1 mL SOC培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后37℃、120 r/min水浴振蕩培養(yǎng)l h。3 000 r/min、2 min離心后去除600 μL上清，剩余沉淀的菌體約輕輕混勻后加在含Amp 0.1 g/L的LB固體瓊脂培養(yǎng)板上，無菌條件下涂抹均勻。晾干后轉(zhuǎn)移至37°C電熱恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)12～16 h。取單克隆菌種接種于裝有3 mL含Amp 0.1 g/L的LB培養(yǎng)液的15 mL離心管中，37℃、120 r/min培養(yǎng)12～16 h。菌液按菌液∶50%甘油比例為4∶1凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 融合蛋白的誘導表達及提取純化

各取10 μL菌種加入到裝有200 mL含0.1 g/L Amp的LB培養(yǎng)液的錐形瓶中，37℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h。當A600在0.8左右時，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，37℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，誘導融合蛋白表達。菌液經(jīng)4 000 r/min離心8 min后棄上清，用10 mL PBS重懸細菌，加入1 mol/L LYS和1 mol/L DTT各100 μL、15%N-Lau 1 mL，混勻后放置于冰上30 min，然后用超聲法粉碎細菌（超聲3 s停7 s，共20 min，冰上進行）。再加入30%TritonX-100 335 μL，冰上放置30 min，充分破碎細菌釋放融合蛋白。16 000 g、8 min離心后將10 mL上清液加入到含200 μL GS-4B beads的15 mL離心管，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合過夜（GS-4B beads用PBS洗3遍，每次800 r/min離心2 min）。第2天用PBS溫柔清洗beads 3次，每次5 mL，800 r/min離心2 min，去除雜蛋白，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CT1及其突變體蛋白的鑒定

用15%SDS-PAGE電泳檢測純化的CT1及其突變體蛋白的相對分子量和純度。

2 結(jié)果

2.1 CT1及其突變體質(zhì)粒的測序結(jié)果

DNA測序結(jié)果顯示CT1及其突變體質(zhì)粒均是含有843 bp的DNA片斷，CT1片斷中位于285 bp處的密碼子ACG（圖1A）分別突變?yōu)镚CT（圖1B）和GAC（圖1C）。這3個密碼子編碼的氨基酸依次為蘇氨酸（T）、丙氨酸（A）和天門冬氨酸（D），該位點氨基酸在Cav1.2通道氨基酸序列全長中對應為第1 603位。因此，結(jié)果表明已成功獲得CT1突變體質(zhì)粒CT1 T1603A和CT1 T1603D。

2.2 CT1及其突變體蛋白的表達與純化

實驗中表達提取的蛋白均為GST-CT1融合蛋白。其中，CT1片斷共有281個氨基酸，分子量約為17.6 kDa，GST分子量約為26 kDa。采用15%SDSPAGE電泳檢測該融合蛋白及其突變體蛋白。如圖2所示：CT1及其突變體蛋白分子量大約為43.6 kDa，與理論值基本一致。表明該方法構(gòu)建并表達所得的CT1及其突變體蛋白均能正常表達。

3 討論

Cav1.2通道的磷酸化調(diào)節(jié)是其重要的調(diào)節(jié)途徑之一，許多調(diào)控因子都是通過對通道的磷酸化和去磷酸化實現(xiàn)調(diào)節(jié)功能［12，13］?；诎被嵝蛄薪Y(jié)構(gòu)，豚鼠Cav1.2通道C末端有17個潛在的磷酸化位點，其中相當一部分位于CT1片段（1 509～1 789）。Erxleben等［14］報道了CaMKⅡ磷酸化Ⅰ～Ⅱ環(huán)上的439位絲氨酸和CT1上的1 517位絲氨酸，引起兔心肌細胞Cav1.2通道2型開放。Lee等［15］也報道了CaMKⅡ磷酸化兔平滑肌鈣通道C末端的1 512和1 570位絲氨酸，促進電壓依賴性易化。前期研究發(fā)現(xiàn)，1 603位蘇氨酸可以被CaMKⅡ磷酸化，并且對Cav1.2起著重要的調(diào)節(jié)作用［11］。CT1片斷及其突變體的構(gòu)建表達有利于進一步研究CT1上各個調(diào)節(jié)位點對Cav1.2通道的調(diào)節(jié)作用和機制，具有十分重要的意義。

圖1 CT1及其突變體重組質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果Fig.1 DNA sequence identification of GST-CT1and its mutants

圖2 純化后的CT1及其突變體GST融合蛋白SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE results of purified GST-CT1and its mutants

原核表達系統(tǒng)發(fā)展日趨完善、操作流程簡單快速、成本低、產(chǎn)量高，尤其適宜于表達原核來源的以及不需要翻譯后修飾的真核蛋白。但在表達具體某種蛋白時，需要對表達條件進行相應的優(yōu)化，以獲得高純度、高表達量的融合蛋白。本研究以豚鼠Cav1.2通道CT1為模板構(gòu)建了2種突變體，采用定點突變技術將1 603位蘇氨酸分別突變?yōu)楸彼幔–T1 T1603A）和天門冬氨酸（CT1 T1603D）。這2種突變體都能正常表達GST融合蛋白，而且所表達的GST融合蛋白均能與CaM結(jié)合，其Ca2+依賴性和CaM濃度依賴與CT1相似。此方法同樣適用于CT1其他位點的突變，為研究Cav1.2鈣通道的磷酸化調(diào)節(jié)奠定了基礎。

［1］Hagiwara S，Byerly L.Calcium channel［J］.Annu Rev Neurosci，1981，4：69-125.

［2］Hofmann F，F(xiàn)lockerzi V，Kahl S，et al.L-type CaV1.2 calcium channels：from in vitro findings to in vivo function［J］.Physiol Rev，2014，94（1）：303-326.

［3］Terkildsen JR，Niederer S，Crampin EJ，et al.Using Physiome standards to couple cellular functions for rat cardiac excitation-contraction［J］.Exp Physiol，2008，93（7）：919-929.

［4］Minor DL，F(xiàn)indeisen JrF.Progress in the structural understanding of voltage-gated calcium channel（CaV）function and modulation［J］. Channels（Austin），2010，4（6）：459-474.

［5］Zhou CZ，Luo D.Electrophysiological characterization of spinal neuron sensitization by elevated calcium channel alpha-2-delta-1 subunit protein［J］.Eur J Pain，2014，18（5）：649-658.

［6］Xu JJ，Hao LY，Kameyama A，et al.Calmodulin reverses rundown of L-type Ca2+channels in guinea pig ventricular myocytes［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2004，287（6）：C1717-1724.

［7］Nie HG，Hao LY，Xu JJ，et al.Distinct roles of CaM and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II in Ca2+-dependent facilitation and inactivation of cardiac L-type Ca2+channels［J］.J Physiol Sci，2007，57（3）：167-173.

［8］Hao LY，Wang WY，Minobe E，et al.The distinct roles of calmodulin and calmodulin kinase II in the reversal of run-down of L-type Ca（2+）channels in guinea-pig ventricular myocytes［J］.J Pharmacol Sci，2009，111（4）：416-425.

［9］Asmara H，Minobe E，Saud ZA，et al.Interactions of calmodulin with the multiple binding sites of Cav1.2 Ca2+channels［J］.J Pharmacol Sci，2010，112（4）：397-404.

［10］Simms BA，Souza IA，Zamponi GW.A novel calmodulin site inthe Cav1.2 N-terminus regulates calcium-dependent inactivation［J］.Pflugers Arch，2014，466（9）：1793-1803.

［11］Wang WY，Hao LY，Minobe E，et al.CaMKII phosphorylates a threonine residue in the C-terminal tail of Cav1.2 Ca2+channel and modulates the interaction of the channel with calmodulin［J］.J Physiol Sci，2009，59（4）：283-290.

［12］Murphy JG，Sanderson JL，Gorski JA，et al.AKAP-anchored PKA maintains neuronal L-type calcium channel activity and NFAT transcriptional signaling［J］.Cell Rep，2014，7（5）：1577-1588.

［13］Fu Y，Westenbroek RE，Scheuer T，et al.Basal and beta-adrenergic regulation of the cardiac calcium channel CaV1.2 requires phosphorylation of serine 1700［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（46）：16598-16603.

［14］Erxleben C，Liao Y，Gentile S，et al.Cyclosporin and Timothy syndrome increase mode 2 gating of CaV1.2 calcium channels through aberrant phosphorylation of S6 helices［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（10）：3932-3937.

［15］Lee TS，Karl R，Moosmang S，et al.Calmodulin kinase II is involved in voltage-dependent facilitation of the L-type Cav1.2 calcium channel：Identification of the phosphorylation sites［J］.J Biol Chem，2006，281（35）：25560-25567.

（編輯 王又冬）

Plasmid Construction and Protein Expression of CT1 Fragment Mutants of Cav1.2 Channel

LEIMing1，ZHAOMei-mi1，F(xiàn)ENG Rui1，WANGHong-mei1，MAONan1，ZHUTong2，HAOLi-ying1
（1.Department of Pharmaceutical Toxicology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China；2.Lab of Environment Biology and Engineering，Northeastern University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo construct prokaryotic expression vectors of the CT1 fragment of Cav1.2 channel and its mutants for CT1-GST fusion protein expression and purification.MethodsTaking plasmid of pGEX-6p-3/CT1 as template，two mutational plasmids（CT1-T1603A and CT1-T1603D）with site directed mutagenesis were constructed.The plasmids were then transformed to E.coli BL21 competent cells，and the transformantswere induced with IPTG forthe expression ofGSTfusion proteins ofCT1 fragmentand its mutants.SDS-PAGE was performed to determine the relative molecular weight and purity.ResultsMutated bases corresponding to the target amino acid site were confirmed by cDNA sequence.High purity of GST-CT1 fusion protein and its mutants were successfully obtained.ConclusionProkaryotic expression vectors of CT1 fragment and its mutants were constructed，and the fusion proteins were successfully expressed were obtained.These results provided a basis for further studies of the function ofCT1 fragmentin the regulation for Cav1.2 channeland its mechanism.

fusion protein；CT1；mutant

R966

A

0258-4646（2015）09-0837-03

國家自然科學基金（31071004）

雷明（1984-），男，碩士研究生.

郝麗英，E-mail：lyhao@mail.cmu.edu.cn

2014-12-08

網(wǎng)絡出版時間：