于爽，武昕，喬瑩

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.中心實驗室；2.婦科，沈陽 110001）

·論著·

乳腺癌手術(shù)前后血清中可溶性E-鈣黏連蛋白的表達(dá)及臨床意義

于爽1，武昕2，喬瑩1

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.中心實驗室；2.婦科，沈陽 110001）

目的檢測乳腺癌患者手術(shù)治療前后血清中可溶性E-鈣黏連蛋白（EC）的表達(dá)并探討其臨床意義。方法采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測42例乳腺癌患者手術(shù)前后、18例乳腺良性病變患者手術(shù)前后以及30例健康人血清中可溶性EC的表達(dá)水平。并分析乳腺癌手術(shù)前后血清中可溶性EC的水平變化及與其臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果乳腺癌患者術(shù)前血清可溶性EC較乳腺良性病變患者和健康人顯著升高；乳腺癌患者術(shù)后血清可溶性EC水平較術(shù)前明顯下降；高分期以及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的血清可溶性EC明顯高于低分期及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）。結(jié)論乳腺癌患者血清可溶性EC在手術(shù)前后的表達(dá)具有特異性并且與腫瘤病理分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，可能成為乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測因素。

血清；可溶性E-鈣黏連蛋白；乳腺癌

乳腺癌是威脅女性健康的最常見惡性腫瘤之一，在過去的50年中其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，并已超過宮頸癌成為女性惡性腫瘤的第一位。乳腺癌的主要致死原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前仍然缺少有效評價乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的理想術(shù)后預(yù)測因素。上皮型鈣黏連蛋白（E-cadherin，EC）是上皮細(xì)胞中重要的細(xì)胞黏附因子，參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。EC的表達(dá)與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，低表達(dá)的EC利于腫瘤細(xì)胞分離繼而脫離原發(fā)灶，從而發(fā)生轉(zhuǎn)移擴散［1］。EC經(jīng)胰酶作用形成1個分子量約為80 kDa的血清可溶性上皮鈣黏連蛋白（soluble E-cadherin，sEC），該片段作為EC的降解形式，在健康人的血液中可以檢測到，并且在腫瘤患者中多表現(xiàn)為高表達(dá)。sEC的高表達(dá)與多種惡性腫瘤預(yù)后相關(guān)［2，3］。然而sEC是否可以作為乳腺癌術(shù)后的預(yù)測因素并不清楚。因此，本研究檢測了42例乳腺癌患者手術(shù)前后血清sEC水平，旨在探討血清sEC在乳腺癌手術(shù)前后的表達(dá)變化及其臨床意義，為乳腺癌患者術(shù)后預(yù)測因素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2013年10月至2014年7月本院手術(shù)治療并病理確診的乳腺癌患者42例（年齡32～64歲，中位年齡48歲）、乳腺良性病變患者18例（年齡22～45歲，中位年齡32歲）的臨床資料，同時選擇同期本院健康體檢中心健康體檢者30例作為對照（年齡26～68歲，中位年齡50歲）。

42例乳腺癌患者臨床分期：I期4例，Ⅱ期19例，Ⅲ期11例，Ⅳ期8例；病理分級：高/中分化18例，低分化24例；腹水15例，無腹水27例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。全部乳腺癌患者均為初治病例并均行乳腺癌根治手術(shù)，術(shù)前均未接受過任何化療或放療。18例乳腺良性病變：乳腺纖維腺瘤10例，乳管內(nèi)乳頭狀瘤2例，乳腺囊性增生病6例。30例健康體檢者血細(xì)胞計數(shù)、血脂、肝腎功能均在正常范圍，并排除相關(guān)腫瘤性疾病。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本收集與處理：采集乳腺良性病變及乳腺癌患者術(shù)前1 d、術(shù)后第14天以及正常人的外周靜脈血各3～5 mL，血樣采集后立即放入4℃冰箱靜置20 min，4℃5 000 r/min離心20 min，分離血清，分裝后放于-80℃冰箱儲存。實驗前冰上融化后，4℃12 000 r/min離心10 min，除去血清中雜質(zhì)。

1.2.2 血清sEC的檢測：采用ELISA方法檢測血清中sEC的水平，ELISA定量試劑盒購自美國R＆D公司。主要操作步驟如下：（1）分別向反應(yīng)板孔中加入50 μL EC標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋后的血清，室溫孵育2 h，洗板；（2）分別向反應(yīng)板孔中加入200 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的重組人EC，室溫孵育2 h，洗板；（3）分別向反應(yīng)板孔中加入200 μL四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）底物顯色液，避光室溫孵育30 min；（4）分別向反應(yīng)板孔中加入50 μL反應(yīng)終止液；（5）在終止反應(yīng)的30 min內(nèi)，檢測樣品在450 nm處的吸光度（A），并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)稀釋后血清的吸光度計算其濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組、乳腺良性病變組以及正常對照組術(shù)前血清中sEC水平的比較

如表1所示：ELISA法檢測3組血清sEC的平均濃度分別為1 953.74，2 573.36和2 031.45 ng/mL。乳腺癌組血清sEC水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；乳腺良性病變組與正常對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 不同受試組血清中sEC的表達(dá)水平Tab.1 The expression levels of serum sEC in different assayed groups

2.2 乳腺癌患者術(shù)前血清中sEC水平與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果如表2所示：分析不同病理特征的乳腺癌患者術(shù)前sEC水平，表現(xiàn)與乳腺癌臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，隨著病程的進(jìn)展以及轉(zhuǎn)移，血清sEC的水平呈逐漸增高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而與病理分級以及是否伴有腹水無顯著相關(guān)（P＞0.05）。

2.3 乳腺癌患者手術(shù)前后血清sEC的水平變化

42例乳腺癌患者全部行根治性切除手術(shù)治療，于術(shù)后1周和2周分別檢測血清sEC表達(dá)水平。結(jié)果如表3所示：術(shù)后1周和2周患者血清sEC平均濃度分別為2 107.28 ng/mL和2 016.33 ng/mL，兩者較術(shù)前均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。術(shù)后1周與2周患者血清sEC表達(dá)水平間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。術(shù)后1周患者血清sEC表達(dá)水平依然高于健康人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），然而術(shù)后2周患者血清sEC表達(dá)水平基本降至健康人水平，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

3 討論

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素參與并涉及多基因變化的進(jìn)行性過程，其主要致死原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。侵襲和轉(zhuǎn)移作為惡性腫瘤的重要特性之一，是一個多步驟、多因素共同參與的復(fù)雜過程。目前的研究普遍認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)的降解和基底膜的重塑是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，此過程需要諸如絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及基質(zhì)金屬蛋白酶等相關(guān)蛋白降解酶的表達(dá)和激活［4］。腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的能力與其侵襲能力密切相關(guān)。目前，乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移機制還不是十分清楚，并且仍然缺少能夠有效評價乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移的理想的術(shù)后預(yù)測因素，因此，尋找理想的預(yù)后指標(biāo)、早期判斷乳腺癌術(shù)后的浸潤轉(zhuǎn)移是目前乳腺癌研究的重點課題［1］。

表2 不同臨床病理特征乳腺癌患者術(shù)前血清sEC水平比較Tab.2 The expression levels of serum sEC in breast cancer patients with different clinical pathological characteristics

表3 乳腺癌患者手術(shù)前后血清sEC的水平變化Tab.3 The expression levels of serum sEC in breast cancer patients before and after operation

EC一種能夠維持上皮細(xì)胞的極性及細(xì)胞間連接的黏附分子，介導(dǎo)細(xì)胞間同質(zhì)黏附，隸屬于鈣依賴性的跨膜糖蛋白。人EC含723～748個氨基酸，其N端胞外區(qū)對Ca2+有高度敏感性，并通過與之特異性結(jié)合而發(fā)揮其細(xì)胞間同質(zhì)黏附功能。EC通過與連環(huán)素相互作用形成鈣黏素/連環(huán)素復(fù)合體，從而行使其功能，包括介導(dǎo)細(xì)胞黏附，調(diào)節(jié)組織與形態(tài)變化，維持上皮細(xì)胞正常的極性和完整性［5］。研究發(fā)現(xiàn)，EC參與不同腫瘤的早期發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移［6～10］。當(dāng)EC表達(dá)降低時，細(xì)胞間黏附力下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞分散，繼而向外周浸潤生長。進(jìn)一步的研究表明，EC調(diào)控細(xì)胞間黏附性的作用是通過抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶［11］，阻止腫瘤細(xì)胞基質(zhì)和基底膜的多種蛋白的降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞突破基質(zhì)以及基底膜屏障而實現(xiàn)的。因此，EC表達(dá)異常與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性，即陽性表達(dá)EC能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

相關(guān)研究表明，EC同樣參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，低表達(dá)的EC有利于乳腺癌的轉(zhuǎn)移擴散［1］。然而，血清中sEC與腫瘤組織中完整E-型鈣依賴黏附蛋白不同，而且血清中sEC與乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性未見相關(guān)報道。與腫瘤組織中完整EC的低表達(dá)相反，本研究結(jié)果表明，血清sEC在乳腺癌患者中的表達(dá)顯著升高。這種表達(dá)差異預(yù)示著組織中完整EC與血清中sEC的表達(dá)調(diào)控機制不同。已知的EC表達(dá)受到其基因突變、啟動子SNP以及組織中相關(guān)蛋白酶活性增加等因素的調(diào)控［12］。基于以上機制，sEC分子血清水平的調(diào)控機制還有待進(jìn)一步研究。此外，本研究還證實了血清sEC的表達(dá)與乳腺癌TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，高分期以及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者其sEC的表達(dá)升高。

綜上所述，本研究通過定量比較乳腺癌患者及手術(shù)前后血清sEC的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)血清sEC的表達(dá)具有一定特異性。表明術(shù)后sEC表達(dá)的下降可能是提示腫瘤預(yù)后有效的一種分子水平的體現(xiàn)，術(shù)前sEC表達(dá)水平的提高有可能是乳腺癌預(yù)后不良的預(yù)測因子。本研究為乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移機制的研究提供了潛在的候選靶分子——血清sEC，并且對尋找理想的判斷乳腺癌術(shù)后浸潤轉(zhuǎn)移的預(yù)后指標(biāo)具有重要意義。

［1］蔡方，趙勇，陸明深，等.乳腺癌生物學(xué)行為變化中鈣黏蛋白、層粘連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白和增殖細(xì)胞核抗原的作用［J］.中國臨床康復(fù)，2004，8（29）：6398-6399.

［2］張自森，吳敏，巴楠，等.晚期胃癌血清可溶性E-鈣粘連蛋白的表達(dá)及其意義［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2011，16（9）：820-822.

［3］李燦宇，申愛榮，張自森，等.檢測血清可溶性E-鈣粘連蛋白在卵巢癌手術(shù)前后的表達(dá)及其意義［J］.河南外科學(xué)雜志，2012，18（5）：6-7.

［4］Kessenbrock K，Plaks V，Werb Z.Matrix metalloproteinases：regulators of the tumor microenvironment［J］.Cell，2010，141（1）：52-67.

［5］Daugherty RL，Gottardi CJ.Phospho-regulation of beta-catenin adhesion and signaling functions［J］.Physiology（Bethesda），2007，10（22）：303-309.

［6］趙敏，李智，于永春，等.膀胱癌組織中上皮細(xì)胞鈣依粘連蛋白基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的分析［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2005，20（1）：55-58.

［7］張夢嵐，賀菊香，李菊英，等.宮頸鱗癌組織中Snai2和E-cadherin的表達(dá)及意義［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（15）：51-52.

［8］袁林，沈世強，盧欣，等.原發(fā)性肝癌患者血可溶性E-鈣黏連蛋白檢測的意義［J］.腹部外科，2013，26（2）：104-106.

［9］Shim HS，Yoon BS，Cho NH，et al.Prognostic significance of paired epithelial cell adhesion molecule and E-cadherin in ovarian serous carcinoma［J］.Hum Pathol，2009，40（5）：693-698.

［10］姜琳，胡軍.E-cadherin-catenins粘附復(fù)合體與卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后之間關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，33（1）：78-81.

［11］Xie T，Yuan XL，Yu SY，et al.Interference of HIF-alpha by RNA reduces the expression of matrix matalloproteinase-2 in human cervical carcinoma HeLa cells［J］.Ai Zheng，2008，27（6）：600-605.

［12］Yu YC，Li HM，Xin XY，et al.Clinical evaluation of E-cadherin expression and its regulation mechanism in epithelial ovarian cancer［J］.Clin Exp Metastasis，2006，23（1）：65-74.

（編輯 王又冬）

Expression and ClinicalSignificance of Soluble E-cadherin before and after Operation in Breast Cancer Patients

YUShuang1，WUXin2，QIAOYing1
（1.Central Laboratory，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Gynecology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo detect the expression of serum soluble E-cadherin（sEC）before and after operation in breast cancer patients，and to explore its clinical significance.MethodsThe levels of sEC in 42 patients with breast cancer and 18 patients with benign breast diseases were tested by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）before and after operation as well as in 30 healthy controls.Its correlation with clinical and pathologicalcharacteristics was analyzed.ResultsThe levels ofsEC in breastcancerpatients before operation were significantly higherthan patients with benign breast diseases and controls，which declined significantly after operation.Moreover，the levels of sEC in those with high clinical grading and lymphatic metastasis were also higher than in the ones with low grading and negative lymphatic metastasis（P＜0.05）.ConclusionThe levels of sEC in breast cancer patients before operation are specific and closely related with pathological grade and lymphatic metastasis，which may be a predictive factorforprognosisofbreastcancer.

serum；soluble E-cadherin；breast cancer

R737.9

A

0258-4646（2015）09-0826-04

于爽（1984-），女，技師，本科.

喬瑩，E-mail：qfm1932@aliyun.com

2014-12-23

網(wǎng)絡(luò)出版時間：